192892. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 2,5-diketo-d-glükonsav-reduktáz előállítására
12 192892 3. táblázat A koenzimek hatása a 25DKG-reduktáz aktivitására Szubsztrátum (egység/l Enzimaktivitás ml tisztított enzimold at) Koenzim: NADPH NADH Ca-25DKG 54 0.2> 5KF 94 0.2> Amint az a fenti táblázatból látható, a találmány szerinti enzim 54 egység/l ml tisztított enzimoldat enzimaktivitást mutat Ca-25DKG-ra, ha az enzimet NADPH-tal használjuk, míg csupán 0,2 egység vagy ennél ki- Bebb enzimaktivitást mutat NADH-dal kombinálva. Hasonlóképpen csökken az 5KF-ra NADPH-tal mért 94 egység aktivitás 0,2 egységre vagy ennél kisebbre NADH-dal. IV) Optimális pH-érték Abból a célból, hogy tisztázzuk az öszszefüggést a 25DKG-reduktáz reakciósebessége és a pH-érték között, az enzimaktivitást az 5)ii) reakciórendszerben használt puffer helyett a kővetkező pufferokat alkalmazva mérjük: pH - 4,0-5,0: 0,1 mólos 3, 3-dimetil-glutársav puffer, 20 pH = 6,0-7,0: 0,1 Mólos Good-puffer (PIPES = piperazin-N, N-bÍBz(2-etán)-szulfonsav), pH = 7,0-9,0: 0,1 mólos trisz-puffer. 25 A Ca-25DKG és 5KF szubszlrátumokra a megfelelő pH-értékeken mért enzimaktivitások eredményeit a 4. táblázat szemlélteti. 4. táblázat A 25DKG-reduktaz aktivitása és a pH-érték az enzimreakcióban pH Puffer Enzimaktivitás*1 (egység/ml) Szubsztrátum: Ca-25DKG 5KF 4.0 3, 3-dimetil-glutársav 1 2 5.0 3, 3-dimetil-glutársav 22 33 6.0 Good (PIPES) 59 96 6.5 Good (PIPES) 57 95 7.0 Good (PIPES) 53 92 7.0 Trisz 54 93 7.5 Trisz 44 68 8.0 Trisz 32 48 8.5 Trisz 11 27 9.0 Trisz 7 13 a) Enzimaktivitás: egység/l ml tisztított enzimoldat A fenti táblázatból világosan látszik, hogy az enzim a legnagyobb enzimaktivitást 6-7 pH-értéken mutatja. V) Az aktivitás összefüggése a hőmérséklettel 50 Az 5)ii) reakciórendszerben Ca-25DKG szubsztrátumot alkalmazva mérjük a rekció mértékét 15 °C és 50 °C közötti, változó hőmérsékleten. Az eredményeket az 5. táblázat szemlélteti. 55 5. táblázat A 25DKG-reduktáz aktivitása és a hőmérséklet közötti összefüggés Hőmérséklet (°C) Enzimaktivitás* (egység/ml) 15 14 25 29 8
