192842. lajstromszámú szabadalom • Eljárás affinitás-szorbensek előállítására
3 192842 4 A találmány tárgya eljáráa az (I) általános képletű új affinitás-szorbensek előállítására P - A - <NH). - CO - B (I)- a képletben P 10 000 éa 100 000 közötti polimerizációfokú, affinitáskromatográfiai célokra alkalmas poliszacharid-típusú hordozót, célszerűen agarózt vagy cellulózt, vagy akril-amid N-(amino-alkil)-akril-amiddal vagy akrilsav-hidraziddal képezett, divinil-vegyülettel térhálósított, 10 000 és 100 000 közötti polimerizációfokú kopolimerjét jelenti az -A-(NH)aH oldallánc nélkül, A -(CHi)«- csoportot - ahol n értéke 1 és 10 közötti egész szám - vagy -CO- csoportot jelent, és ha A -(CHj)p- csoportot jelent, m értéke 1, míg ha A -CO-csoportot jelent, m értéke 2, és B egy aminosav, polipeptid vagy neurotranszmitter-karbonsav maradékát jelenti a -COOH vógcsoport nélkül. Az aminosavak, polipeptidek (beleértve a di- és oligopeptideket is; ezek jellemző képviselői a hormonok) és a neurotranszmitter-karbonsavak immobilizálása polimer hordozón több szempontból is nagy jelentőségű, mert a tudományos kutatásban sokoldalúan felhasználható szorbenseket eredményez. Ezek a szorbensek felhasználhatók affinitás-kromalográfia céljára, a hormonok szolubilizált receptorainak tisztítására, hormonokkal mint antigénekkel szemben nyert antiszérumok tisztítására, antitestek izolálására, enzimek izolálására és tisztítására. Ezen kívül a megfelelő affinitás-szorbensek segítségével, az immobilizált hormon és receptora közötti kölcsönhatás alapján élő sejtek is tisztán izolálhatok. Ha az affinitás-szorbenseket mikroszkóp tárgylemezén élő sejtek szuszpenziójával inkubálják, majd mikroszkóppal vizsgálják a sejtek kötődését az affinitás-szorbensen, megállapítható, hogy az adott sejttípus tartalmazza-e a vizsgált receptorokat a sejtmembránon (affinitás-mikroszkópia). Az affinitás-szorbensek adott hormonnal, illetve neurotranszmitterrel szemben termelt antiszérumok fajlagosságának ellenőrzésére, antitestek specifitásának kvalitatív értékelésére, továbbá egyes esetekben (így autoimmun betegségeknél) gyógyászati célokra is alkalmazhatók. Mindezen felhasználási terület szempontjából alapvető fontossága van annak, hogy az affinilás-szorbens a rajta lévő immobilizált aminosav-, peptid- vagy neurotranszmitter-karbonsav-molekulákat kémiailag egységes és biológiailag aktív állapotban tartalmazza. Az affinitás-szorbensek előállításához hordozókként csak hidrofil polimerek használhatók fel. Erre a célra a legszélesebb körben különféle poliszacharidokat (így 'poli-aldo-hexózokat és azok szubsztituált származékait, például agarózt, cellulózt dextránt, karboxi-metil-cellulózt és karboxi-etil-cellulózt) alkalmaznak. Az eddig ismert megoldások szerint a biológiailsg aktív molekulát aminocsoportján keresztül kapcsolták a hordozóhoz, például úgy, hogy agarózra előzetesen brómciánnal c-amino-kapronsavat vittek fel, az így kialakított, karboxil funkciós csoportokat tartalmazó hordozó funkciós csoportjait N-hidroxi-szukcini'mid-észterré alakították, és az aktív észterhez kapcsolták aminocsoportjukkal a rögzítendő aminosavat, peptidet vagy neurotranszmittert (Biochemistry 11, 2291 (1972)1. Ennek a megoldásnak az a hátránya, hogy több aminocsoportot tartalmazó, biológiailag aktív molekulák többféle módon is kapcsolódhatnak a hordozóho2,, azaz a végtermék nem tartalmazza a felvitt biológiailag aktív molekulákat kémiailag egységes állapotban. További hátrányt jelent, hogy a kapcsolás serén, amikor az aminocsoportot savamidcsoporttá alakítják, a biológiai aktivitás csökkenhet vagy elveszhet. Egy másik ismert megoldás szerint a kapcsolandó molekulát biotinhez kötik, majd a biotinil-aminosavat, -peptidet vagy - neuretranszmittert avidin-agarózhoz kapcsolják igen erős, szelektív kötéssel ÍProc. Natl.-Ac.ad. Sei. USA 73, 3516 (1979)1. Noha ez a módszer lehetővé teszi kémiailag egységes szerkezetű affinitás-szorbensek előállítását, komoly hátrányt jelent, hogy a kapcsoláshoz használt biotinil-vegyületek is igénybe veszik a kapcsolandó molekulák legalább egy aininocsoportját, ami a biológiai aktivitás csökkenéséhez, esetenként megszűnéséhez vezet. Szükség van tehát olyan eljárásra, amellyel a kémiailag egységes szerkezetű (tehát az összes felvitt molekulát azonos módon megkötve tartalmazó) affinitás-szorbensek a felvitt molekula biológiai aktivitásának csökkenése nélkül állíthatók elő. Minthogy az immobilizálandó molekulák biológiai aktivitása szempontjából általában alapvető jelentősége van annak, hogy a szabad aminocsoportok reagálatlanok maradjanak, kézenfekvő megoldásnak tűnne, ha ezeket a molekulákat karboxilcsoportjuk igénybevételével kapcsolnák a hordozókhoz. Nehézségek származnak azonban abból, hogy az affinitáskromatográfiai célokra felhasználható polimer hordozóknak hidrofil anyagoknak kell lenniük; ezek azonban savakra rendkívül érzékenyek. Sav hatására a poliszacharid váz sérül, hidrolízist és bomlást szenved, így ha a szabad karboxilcsoportot és védett aminocsoportot tartalmazó, biológiailag aktív molekulát a poliszacharid vázhoz kapcsoljuk, majd az aminocsoport védő csoportját ismert módon, erős savas kezeléssel lehasítjuk, a végtermék olyan szerkezeti változásokon megy keresztül, amelyek hatására affinitáskromatográfiai célokra alkalmatlanná válik. A szilárd fázisú peptid-szintézisben felhasznált 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
