192765. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fermentációban keletkező glükonsav mennyiségének növelésére
4 192765 5 kedvezőtlen a kalcium-glukonátot eredményező fermentációnál, mert a keletkező termék kiválásának veszélyét jelenti. Találmányunk azon a felismerésen alapul, hogy ha az átalakítási közeghez adott 5 koncentrációban kémiai katalizátort adunk, a keletkező hidrogénperoxid lebomlása lényegesen meggyorsul és teljessé válik. A katalizátor a szükséges pontos mennyiségben adagolható, vizes odlatban könnyen bevihető és 10 a felhasznált koncentrációban a mikroorganizmusra nem káros. A fentiek alapján a találmány eljárás Aspergillus törzsek felhasználásával végzett fermentációban keletkező glükonsav mennyi- 15 ségének növelésére, amely abban áll, hogy az önmagában ismert fermentációs eljárás során keletkező és a kataláz enzim által el nem bontott hidrogénperoxidot 10-100 mg/liter, előnyösen 10-50 mg/liter koncentrációban ké- 20 miai katalizátorral, előnyösen mangán(III)-, mangán(IV)- vagy ólom(IV)-oxíddal elbontjuk. A találmány szerinti eljárás egy előnyös kivitelezési módja szerint eljárva a katalizátort 10-50 mg/liter fermentlé mennyiségében 25 a fermentáció indításakor egyszerre vagy a folyamat közben ismételt adagolással juttatjuk a rendszerbe. A szükséges katalizátor-mennyiség kiszámítását célszerűen úgy végezzük, hogy 30 meghatározzuk a rendszer glükóz-oxidációs sebességét, ebből a hidrogénperoxid keletkezési sebességét és olyan mennyiségű kémiai katalizátort alkalmazzuk, mely a keletkező peroxid 30-60%-ának azonos sebességű lebon- 35 tására képes. A találmány szerinti eljárás előnyei az alábbiakban foglalhatók össze: 1. A kémiai katalizátorral kiegészített biokonverziós rendszerben 300-350 g/liter 40 glükóz oxidálható anélkül, hogy ismételt szubsztrát adagolásra volna szükség. 2. A rendszer pH-ja a folyamatra kedvező 5,5-6,0 értéken tartható. 3. A keletkező glükonsav tetszés szerint le- 45 köthető kalcium-, nátrium- vagy ammónium-só formájában. 4. Az átalakítás sebessége másfél-kétszeresére nő, ami elsősorban a biokonverzió előrehaladott fázisában jelent lényeges kü- 50 lönbséget, ahol kémiai katalizátor nélkül a hidrogénperoxid által károsított sejtek aktivitása rohamosan romlik. 5. Az eddig ismert eljárásoknál a fokozatos sejtkárosodás következtében általában 55 nem teljes a glükóz konverziója, egyes esetekben az átalakítás 5-10% maradék szubsztrátnál leáll. A káros hidrogénperoxid lebontása révén az oxidáció hatásfoka javul cs az elérhető konverzió 99% vagy 60 annál jobb érték. 6. Jobb hatásfokú konverzió miatt javul a termék minősége, csökken a termék redukáló-cukor tartalma. 7. Az eljárás alkalmazásának módja egyszerű, nem kíván külön berendezést. A találmány szerinti eljárás kivitelezését az alábbi példákon szemléltetjük: 1. példa Aspergillus niger (ATCC 9029; NRRL-3 jelű törzzsel 10 literes laboratóriumi fermentorban 5 1-es hasznos térfogatban sterilen végeztük a fermentációt. A táptalaj összetétele: glükóz 200.0 g kálium-klorid diammóniura-hid-0.2 g rogén-foszfát 2.0 g karbamid 1.0 g magnán(IV)-dioxid 0.020 g=20 mg/1000 ml Az inokulum spóra-szuszpenzió mennyisége a hasznos térfogat 0.2%-a. A tenyésztést 32-34 °C-on 1 liter levegő/líter fermentlé percenkénti levegőztetés mellett végezzük. A fermentáció ideje 36 óra, a maradék glükóz mennyisége 0,3 tőmeg%. A sejtmentes fermentlevet 55-60 °C-ra melegítjük, majd egy órán át keverjük, közben literenként 5 g aktiv szénnel derítjük. Az oldatlan részt és a szenet kiszűrjük, majd az oldathoz még melegen literenként 25 g kalcium-karbonátot adunk és annyi jégecetet csepegtetünk, hogy az oldat pH-ja 4,8-5,2 érték között legyen. A kalcium-karbonát teljes beoldódása (ezt a széndioxid-fejlődés megszűnése jelzi) után az oldatot szobahőmérsékletre hütjük, majd literenként 100-500 ml metanol hozzáadásával kristályosítjuk. A kristályokat szűrjük, desztillált vízzel mossuk, súlyállandóig szárítjuk. Termék: 185,5 g/1 kalcium-glukonát. A termék minősége megfelel a gyógyszerkönyvi előírásoknak, a Fehling-reakció negatív. 2. példa Aspergillus niger (ATCC 9029; NRRL-3 jelű) 48 órás rázott tenyészetével oldottuk a 6 liter hasznos térfogatú fermentort steril körülmények között. Az inokulum mennyisége táptalaj térfogatának 2%-a. Az inokulum táptalaj összetétele: glükóz 200.0 g kukoricalekvár 10.0 g kálium-klorid 0.2 g magnézium-szulfát 0.1 g kálium-dihidrogén-foszfát 0.25 g kalcium-karbonát 30.0 g) A fófázis táptalajának összetétele: glükóz 300.0 g diammónium-hidrogén-foszfát 2.0 g 4
