192765. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fermentációban keletkező glükonsav mennyiségének növelésére
2 192765 3 A találmány tárgya új eljárás glükonsav termelésre képes, előnyösen Aspergillus niger törzs termelőképességének növelésére. Ismeretes, hogy a baktérium-, vagy gomba-törzsek alkalmazásával végzett glükóz-oxidáció egyike a legkorábban alkalmazott ipari fermentációs eljárásoknak. A folyamatban keletkező glükonsav alkalmas arra, hogy különböző egy és kétértékű kationokkal sót képezve az illető kationok, elsősorban fémek, biológiai hatékonyságát elősegítse. A nagyüzemi módszerek elterjedésével fokozott szükség van az élő szervezet igényeinek megfelelő fémsó-arányok beállítására. A glükonsav sói közül kiemelkedő jelentőségű a kalcium-glukonát, mely a kalcium bevitelét segíti elő terápiás célok szolgálatában. Jelentős a glükonsav ammonium-, nátrium- és kálium-sója mint ipari termék, de ezek egyúttal intermedierek is lehetnek az egyéb glukonát-sók előállítása során. A forgalmazott fémsók közül a kalcium-, magnézium-, kobalt-, réz-, vas-, mangán-, kálium- és a cink-glukonát a legismertebb. Nagy mennyiségű glükonsav-sót használt fel az építőipar (cementkötés-gyorsitóként), a fémipar (rozsdaeltávolításban, korrózióvédelemben), a textilipar (felületkezelésnél), az élelmiszeripar (diétás készítményekben) és a kozmetikai ipar (dezodoroknál) is. Sajátos módon a glükonsav mikrobiológiai előállításánál a kitermelés a ma ismert publikus adatok alapján sem éri el a kívánt szintet, miután átalakulatban szubsztrát - elsősorban glükóz - marad a rendszerben. A legutóbbi időben ezért több próbálkozás történt a hatékonyabb konverzió érdekében. Az 1 817 907 sz. NSZK-beli közzétételi iratban ismertetett eljárás szerzői például úgy próbálják növelni a hatékonyságot, hogy a pH-értéket szűkebb tartományban (pH=5-7) tartják és a glükózt fokozatosan adagolják a rendszerhez. Az eljárás hátránya, hogy a glükózt külön kell sterilezni és a többszöri beadagolás miatt veszélyeztetett a fermentor sterilitása. Más esetben mutáns törzseket állítanak elő, például a 141 129 sz. indiai szabadalmi leírás szerint. A konverzió és a hatásfok ez esetben sem kielégítő, mivel a keletkező glükonsavat kalcium-karbonáttal neutralizálják, így a keletkezett kalcium-glukonát kiválik és a fermentlé nehezen kezelhető heterogén fázisú lesz. Más fejlesztési törekvés a szubsztrát megváltoztatásával olcsóbb nyersanyag hasznosítására vonatkozik. Így az 50 154 484 sz. közrebocsátott japán szabadalmi bejelentésben szaharózt, az 55 023 975 sz. közrebocsátott japán szabadalmi bejelentésben cellulózt alkalmaznak szubsztrátként. Az eljárások hátránya az, hogy az előbbi eljárásban folyamatosan fruktóz keletkezik és ezt el kell távolítani a rendszerből, míg a másik eljárásban a cellulóz hiányos lebontása limitálja a glükóz átalakítás sebességét. A találmány célja az ismert módszerek hátrányainak kiküszöbölésével olyan eljárás kidolgozása, melynek során egyszerű módon gyakorlatilag teljes konverzió érhető el és az átalakítás után kapott termék nem tartalmaz átalakulatlan szubsztrátot. Munkánk során abból indulunk ki, hogy a glükóz mikrobiológiai oxidációjának enzimes mechanizmusát vizsgáltuk. Ismert, hogy a reakció enzimes mechanizmusa a következő: beta-D-glükopiranózt a glükóz-oxidáz-enzim D-glükonsav-delta-laktonná oxidálja a glükóz-oxidáz koenzimje (FAD=Flavin-adenin-dinukleotid) redukciója közben, mely molekuláris oxigén belépésével visszaoxidálódík. Ezután a FADHz-ról felszabaduló hidrogén a levegő oxigénjével hidrogénperoxidot képez. A keletkező glukonolakton víz és az alkalmazott kation belépésével megképzi a kívánt sót. Megállapítottuk, hogy a reakció csak abban az esetben végezhető megfelelő sebességgel, megfelelő hatásfokkal és a folyamat csak abban az esetben tartható fenn gyakorlati célokat is kielégítő ideig, ha a második ún. kísérő, vagy segédreakcióban a keletkező hidrogénperoxid elbomlik. Ellenkező esetben a felhalmozódó hidrogénperoxid toxikussá válik a glüküzőxidázra és annak működését leállítja- Sót, amennyiben az eljárás ép sejtes tenyészettel történik és a biokonverzió párhuzamosan fut a mikroorganizmus növekedésével, úgy a hidrogénperoxid hiányos lebontása a sejt növekedését is leállítja. A glükonsav termelésére használt mikroorganizmusok különböző mértékben képesek kataláz enzim termelésére, az elvileg biztosítja, hogy a hidrogénperoxidból ismét víz és oxigén szabaduljon fel, a gátló molekula bontása tehát egyidejűleg a szükséges oxigén pótlását is szolgálja. Vizsgálataink során azt a váratlan megfigyelést tettük, hogy glükóz-oxidázzal és -katalázzal rendelkező mikroorganizmus ép sejtes tenyészetét alkalmazva a két funkció természetes egyensúlya csak azért állhat be, mert a köztes hidrogénperoxid halmozódása fékezi az első reakció sebességét, a sebességcsökkenés pedig lehetőséget ad a második folyamat arányának helyreállítására. Kataláz aktivitás növelésére végzett vizsgálataink azt igazolták, hogy a mikroorganizmus aktivitása a törzs szelekciójával, a pH-érték pontosításával, az elötenyésztés változtatásával, vagy a hidrogénperoxidot termelő szubsztrát fokozatos adásával csak igen kis mértékben javítható és a kataláz-aktivitás érdekében végzett körülményváltozások sok esetben a folyamat más tényezőinek hátrányára vannak. így például, ha a pH-t az enzimes hidrogénperoxid bontásnak kedvező 6,0 feletti értékre emeljük, ez hátrányos az alacsonyabb tartományban kedvezően működő glükózoxidázra és ugyancsak 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
