192617. lajstromszámú szabadalom • Eljárás különleges tisztaságú hialuronsav előállítására
192 617 2 padék eltávolítására. A felülúszóban, illetve szűrletben 1 súly/térf.% nátrium-kloridot oldunk. Ezután az oldathoz a HA kicsapására 2 térfogat megfelelő alkoholt adunk. A csapadékot legalább egy órán át hagyjuk üllepedni, majd centrifugálással vagy szűréssel elkülönítjük. A HA vizes oldását, az ezt követő 1,0% nátrium-klorid adagolást, majd az alkoholos kicsapást addig ismételjük folyamatosan csökkenő térfogatban (az eredeti térfogat 1/20-1 /100-ában), míg a HA-vízes oldata tiszta lesz. Ehhez általában legalább négy további alkoholos kicsapási lépés szükséges. A következőkben az eljárás vázlatát ismertetjük. Bakteriális hialuronsav extrakciójának vázlata 1. Streptococcus törzs tenyésztése 2. 1 ml/1 10%-os SLS adagolása 3. 10—40 ml/1 10%-os hexadecil-trimetil-ammónium-bromid hozzáadása 4. A csapadék összegyűjtése 5. Oldás 2 mol/1-es kalcium-klorid-oldatban 6. A csapadék eltávolítása 7. Az oldatból 2 térfogat alkohollal a HA, kevés nukleinsav és fehérje kicsapása 8. A csapadék összegyűjtése 9. A csapadék oldása ionmentes desztillált vízben 10. Az oldatlanul maradt csapadék eltávolítása 11. A felülúszók összegyűjtése 12. 1% nátrium-klorid és 2 térfogat alkohol adagolása a HA kicsapására 13. A csapadék összegyűjtése 14. A csapadék oldása ionmentes desztillált vízben 15. A csapadék eltávolítása, a felülúszó összegyűjtése 16. 1% nátrium-klorid és 2 térfogat alkohol adagolása a HA kicsapására 17. A csapadék összegyűjtése 18. A csapadék oldása ionmentes desztillált vízben 19. A csapadék eltávolítása, a felűlúszó összegyűjtése 20. Szűrés fehéijék megkötésére alkalmas anyagon, például nitro-cellulózon (a visszamaradt minimális mennyiségű fehérje eltávolítására) 21. 1% nátrium-klorid és 2 térfogat alkohol adagolása a HA kicsapására 22. A csapadék összegyűjtése 23. Oldás 0,15 mol/l-es, pH=7,2 foszfáttal pufferolt sóoldatban 24. 1%-os HA koncentráció beállítása spektrofotometriás vizsgálattal 25. Sterilezés 0,1% (3-propiolaktonnal 4-10 °C-on 24—48 órán át 26. A j3-propiolakton elhidrolizása 37 °C-on 24—48 órán át 27. A fecskendő megtöltése. Az előállítási eljárás utolsó lépései közé 95%-os etanollal és 99%-os acetonnal való mosást, majd vákuumban történő szárítást is beiktathatunk. A szárított HA-ból 0,15 mol/l-es nátrium-foszfát pufferben 1,0%-os oldatot készítünk. Ezt az oldatot 0,45 p-os nitro-cellulóz típusú szűrőn szűrjük át és/vagy 0,1% (3-propiolaktonnal sterilezzük. A (3-propiolaktonnal végzett sterilezést 4 °C-on, 24—48 órán át végezzük, majd a (3-propiolaktont 37 °C-on 24—48 óra alatt elhidrolizáljuk. A végtermék 10 mg/ml HA-t tartalmaz 0,15 mol/l-es foszfátpufferben. Az ismertetett eljárás szerint magas, 99,90% feletti hozammal igen nagy tisztaságú HA-t nyerünk. 1 10 1-es fermentorban tenyésztett Streptococcus equi tenyészetből például 5—7 g száraz sejttömeget és 1,0—2,5 g száraztömegű HA-t nyerünk. A hozam ennek megfelelően 14,3—50 súly%. Az előzőekben már hivatkozott 4 141 973. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban kakastaréjból történő extrahálás hozama 0,079% körüli. Meg kell jegyeznünk, hogy a tisztítási eljárás végső szakaszában az oldatot fehérjét megkötő szűrőn, például nitrocellulóz szűrőn át kell szűrni, hogy a végtermékül kapott HA ne tartalmazzon reaktivitást okozó fehérjét. Az egyéb típusú szűrők, például a cellulóz vagy a cellulóz-acetát — a lóízületbe beadott injekciók hatása alapján — nem szüntetik meg megfelelően a reaktivitást. Úgy véljük, hogy ez a szűrési lépés eltávolítja a HA-ban maradt igen kis mennyiségű reaktív fehérjét. A bakteriális eredetű HA tisztaságát kolorimetrikus fehérjevizsgálattal, U. V. spektrofotometriás eljárással, nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással és lemezen végzett gélelektroforézissel igazoltuk. Kezdeti kísérleteinkben a fehérjeszennyezés mennyiségét BIO RÁD fehérje vizsgáló eljárással mértük. Ez az eljárás 200 pg/ml fehérjeszint mérésére már alkalmas. Az I. táblázatban különböző Streptococcus equi fermentációs tenyészetekből nyert 1%-os hialuronsav oldatok féhéijetartalmának vizsgálati eredményeit ismertetjük. I. Táblázat BIO RÁD fehérje vizsgálati eredmények Minta O. D. 595 m p-n Fehérje koncentráció 1. Fermentáció 0,00; 0,000 >200 pg/ml 2. Fermentáció 0,00; 0,010 >200 pg/ml 3. Fermentáció 0,00; 0,005 >200 pg/ml 4. Fermentáció 0,00; 0,005 >200 pg/ml Ezen adatok alapján a bakteriális eredetű 1,0%-os HA-oldat fehérjetartalma >0,001%. Másik, a fehéijék, peptidek és/vagy aminosavak mennyiségének meghatározására alkalmas módszer az U. V. abszorpció mérése 280 m p-nál. Kontrollként ismert koncentrációjú marha-szérumalbumint alkalmazunk. A B. táblázatban ezt a 280 m p-nál mért U. V. abszorpciót, valamint ugyanezen oldatok 257 m u-nál mért abszorpcióját hasonlítjuk össze. A 257 m p-nált mért abszorpció a nukleotid és nukleinsav, azaz RNS és DNS szennyezések mennyiségét mutatja. Megjegyezzük, hogy a 280 m p-nál mért abszorpció nagyobb mennyiségű fehérjeszennyezés jelenlétét mutatja, mint az előzőekben ismertetett BIO RÁD vizsgálat. A bakteriális eredetű 1%-os HA- oldat legfeljebb 0,12% 280 mp-nál abszorpciót mutató szennyezést nem tartalmaz. Mivel ugyanezek az oldatok nukleinsav szennyezést nem tartalmaznak, tisztaságuk legalább 99,88%. Ebből a szempontból jelentős még, hogy hasonlóan előállított HA-ban aminosavanilizis alapján 0,04%-náI kevesebb fehérje van jelen. Ez azt jelenti, hogy a HA tisztasága 99,96%. Készítményünk tisztaságát összehasonlítottuk a kereskedelmi forgalomban kapható, kakastaréjból előállított HA készítmények, a HYARTILR (Pharmacia) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
