192617. lajstromszámú szabadalom • Eljárás különleges tisztaságú hialuronsav előállítására
2 1 192 617 értünk. A „szűk határok között szabályozott nagy molekulatömegű” kifejezésen azt értjük, hogy a HA- nak legalább 98%-a egy adott nagy molekulatömeg tartományon, előnyösen 2. 106 — 4. 106 értéken belül van, és a molekulatömeg eloszlása nagynyomású folyadékkromatográfiás vizsgálat alapján — amelynek ismertetésére a későbbiekben térünk ki — lényegében egyetlen, alapjában véve szimmetrikus csúccsal jellemezhető. „Hialuroidáz negatív” kifejezésen azt értjük, hogy az organizmusból eredő mérhető mennyiségű extracelluláris hialuronidáz, amely a HA-t kis molekulákra bontaná, nincs jelen. „Hialuronidáz-gátolt” kifejezésen azt értjük, hogy valamiféle inhibitor, például hő- vagy enziminhibitor alkalmazásával megakadályozzuk a HA lebomlását kisebb molekulákra. A következő példákban a találmány szerint előállított HA tisztaságát és hatásosságát ismertetjük, összehasonlítjuk a találmány szerinti HA készítményt a kereskedelmi forgalomban lévő HA készítményekkel a különféle HA készítményeket lovak ízületi nedvének helyettesítésére alkalmazva. Természetesen a termék más emlősökben - beleértve az embert is — bármely olyan felhasználási célra alkalmas, amelynél, mint például testnedvek helyettesítésére vagy egyéb, például kozmetikai célú felhasználás esetén, a HA termék igen nagyfokú tisztasága a követelmény. A találmányt bemutató példában a Streptococcusok C csoportjába tartozó ismert HA termelő törzset, a Streptococcus equi-t használtuk HA termelésre. Az alkalmazott tenyésztési és tisztítási eljárás új. Bemutatjuk, hogyan lehet az eljárással az ultratisztaságú, szabályozott molekulatömegű terméket nagy hozammal előállítani. Az átlagos hozam 31 súly%, míg a kakastaréjból kiinduló ismert eljárás hozama 0,079 súly%. Ily módon a találmány szerinti eljárás a gazdasági előnyöket és a nagyobb tisztaságú, jobban szabályozott molekulatömegű termék előállításának lehetőségét egyesíti magában. Az eljárásban alkalmazott Streptococcus equi törzs mintáját az American Type Culture Collection, Rockville, MD 20852 deponálási helyen A. T. C. C. 39506 számon 1983. nov. 9-én helyeztük letétbe. Mint azt már az előzőekben említettük, régóta ismeretes, hogy az A és C csoportbeli Streptococcusok burkának egyik fő komponense a HA. A HA-nak a burokban való előfordulását (hialuronát burok) reprezentáló Streptococcust ismertetnek közleményünkben Beachey és Stollerman [Trans. Assoc. Am. Physicians Phila., 85 212-221 (1972).] A HA burok, mely a sejt legkülső komponense, a teljes Streptococcus sejtnek nagy hányadát teszi ki. A Streptococcus tenyészet szaporodása során ez a burok megfigyelhető a tenyészetnek tussal való megfestése után. A burok ilyenkor fényes udvar formájában látható a sejtek körül. Megállapítottuk, hogy a néhány szabályozott fermentációs rendszerben szaporított Streptococcus törzs a maximális burokképzést a logaritmikus szaporodási fázis kezdetétől számítva 4—6 óra múlva éri el. A logaritmikus fázis végső szakaszában és a stacionárius fázisban a látható burok eltűnik. Ismeretes, hogy egyes Streptococcus törzseknél a burok eltűnése a hialuronidáz enzim degradáló hatásának a kövezkezménye. Hosszú időtartamú — 2-5 napos tenyésztés — fermentálást végezve, legalább egy Streptococcus C csoportba tartozó törzset (Streptococcus equit) szabályozott pH és hőmérsékletviszonyok és glukózszint mellett tenyésztve, megállapítottuk, hogy a HA hozam meglepő módon akkor is 5 jelentősen növekszik, amikor a burok már nincs láthatóan jelen a tenyészetben. Vizsgálataink során arra a következtetésre jutottunk, hogy a törzs valószínűleg nem termel hialuronidáz enzimet. így, ha extracelluláris hialuronidáz negatív Streptococcus törzseket a HA 10 termelés céljának megfelelően szabályozott körülmények között tenyésztünk, rendkívül tiszta, igen specifikus molekulatömegű HA-t nyerünk. A hialuronidáz enzim hiánya a HA előállításának egyik fontos tényezője. 15 A találmány tárgya rendkívüli tisztaságú, nagy molekulatömegű hialuronsav előállítása baktérium, például Streptococcus törzsek segítségével. A kapott HA sérült ízületek szinoviális nedvének pótlására alkalmazható, miáltal az ilyen ízületek mozgásgátoltsága és da- 20 gadása csökken. Az előállítási eljárás legkedvezőbb változata értelmében Streptococcus C csoportba tartozó törzset fermentálunk 37 °C-on, pH 7,0 és 7,2 között, 24—120 órán át. A tenyésztéshez az I. van de Rijn [Infect, and 25 Immun., 27 444—448 (1980)] által ismertetett speciális, kémiailag meghatározott tápközeget alkalmazzuk. Ez a tápközeg azért előnyös, mert nem tartalmaz a későbbi tisztítási lépéseknél eltávolítandó fehérjét. Szénforrásként 24 órás időszakonként glukózt adunk 30 a tenyészethez. A fermentálást állandó pH szabályozás mellett végezzük, minden glukóz adagolás után 7,6-ra állítjuk a tenyészet pH-ját. A fermentálás befejezését megelőzően körülbelül 12 órával a pH szabályozást beszüntetjük, hagyjuk, hogy a tenyészet 35 pH-ja 6,5—6,8 értékre csökkenjen, amely értéken a tenyészet szaporodása megszűnik. Ezáltal hatékonyabban végezhető el a centrifugálás és némiképpen javul a HA hozam. A fermentálás befejeztével legalább 0,01% nátri- 40 um-lauril-szulfátot (SLS) vagy ekvivalens mennyiségű anionos detergenst adunk a tenyészethez, hogy a hialuronsavat kiszabadítsuk a sejtekből. Legalább 15 perc elteltével a tenyészethez titrálás alapján megszabott mennyiségű 10%-os hexadecil-trimetil-ammóni- 45 um-bromidot vagy ekvivalens mennyiségű nemionos detergenst adunk, amellyel csapadékot képezünk. Általában 10,1, előzőleg SLS-tal kezelt tenyészethez 100—400 ml nemionos detergenst adunk, a HA és az SLS lecsapására. A maximális csapadékképződés 50 érdekében a kezelt fermentlét legalább 1 órán át állni hagyjuk, majd a csapadékot szűréssel vagy centrifugálással összegyűjtjük. A csapadékot ezután 2 mol/l-es kait ium-klorid-oldatban az eredeti térfogatnak körülbelül az 1/10 — 1/20-ára oldjuk. Az oldást legalább 6 55 órán át, 4—30 °C hőmérsékleten végezzük. A kapott szuszpenziót a sejt szilárd anyagait és a detergenseket tartalmazó csapadék eltávolítására centrifugáljuk vagy szűrjük. A felülúszót, illetve szűrletet 2 térfogat alkalmas alkohollal, előnyösen 95%-os etanollal vagy 60 99%-os izopropanollal extraháljuk. Zselatinszerű csapadék keletkezik, amelyet 1 óra állás után centrifugáld ssal vagy szűréssel összegyűjtünk. A kapott csapadékot éjszakán át 4—10 T-os ionmentes desztillált vízben az eredeti térfogat 1/10 — 1/20-ára old- 65 juk. A szuszpenziót centrifugáljuk vagy szűrjük a csa3
