192617. lajstromszámú szabadalom • Eljárás különleges tisztaságú hialuronsav előállítására
1 192 617 2 A találmány tárgya általában eljárás hialuronsav és sóinak előállítására és tisztítására, valamint hiahironsavat és sóit tartalmazó gyógyászati készítmény előállítására; különösképpen hialuronsav mikrobiológiai úton való előállítására. 5 A hialuronsav a természetben előforduló, nagy molekulatömegű, (C^HjoNOuín általános képletű — ahol n > 1000 — poliszacharid. A hialuronsav szerkezete a Merck Index 9. kiadása (3. utánnyomás, 1978) 624. oldalán látható. Közismert, hogy a 10 hialuronsav és sói (amelyekre a továbbiakban együttesen a HA jelölést használjuk), legalább 3 forrásból nyerhetők: emberi köldökzsinórból, kakastaréjból és bizonyos baktériumok, például a hemolitikus streptococcusok A és C csoportjának tenyészetéből. Ismere- 15 teink szerint ezidáig kereskedelmi forgalomba kerülő HA előállítása csak köldökzsinórból vagy kakastaréjból történt. Ez a tény némiképpen meglepő, ismerve azokat a hátrányokat — viszonylag alacsony hozam, kondroitinszulfáttal szennyezett HA nyerése, munka- 20 igényes előállítási és tisztítási eljárás —, amelyek e két forrás alkalmazásával járnak. Mivel a HA a csarnokvízben és emlősök ízületeinek szinovális folyadékában előfordul, a szem és az ízületek patológiás állapotának megváltoztatására használ- 25 ható, a fenti folyadékok helyettesítésére alkalmas tisztított HA-ra jelentős igény van. A HA előállítását emberi köldökzsinórból és kakastaréjból és a HA alkalmazását szem és Ízületek kezelésére E. A. Balazs írta le a 4 141 973. számú amerikai egyesült államok- 30 beli szabadalmi leírásban. A fenti szabadalmi leírásban a HA elkülönítésére, jellemzésére és alkalmazására vonatkozó részletes ismertetés szerepel. E. A. Balazs a 4 303 676. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban kakastaréjból ki- 35 nyert különböző molekulatömegű nátrium-hialuronát frakciókat tartalmazó kozmetikai készítményeket ír le. L. G. Page a 4 328 803. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ultratisztaságú hialuronsav szem sebészeti alkalmazását ismerteti. Az alkal- 40 mázott HA ez esetben a HYART1LR márkanéven forgalomba hozott, kakastaréjból nyert nátrium-hialuronát, a Pharmacia Inc. terméke. Hialuronsav bakteriális előállítását és tisztítását ismertetik többek között a Chemical Abstract 74 45 108497; 74 73058 és 99 103736 helyein hivatkozott közleményekben. Ezekben az eljárásokban a hialuronsavat a tenyészetből a baktériumsejtek előzetes roncsolása után nyerik ki. Ily módon a sejtekből szabaddá váló fehérje a hialuronsavat szennyezi. Ennek a fe- 50 hérjeszennyezésnek az eltávolítása nehéz és költséges. Ugyancsak hialuronsav baktériumból való extrahálását ismertetikKjemésLebech, [ActaPath.Microbiol. Scand. Sect. B, 84 162-164, (1976),] de olyan táptalajt és eljárást írnak le, amelyek bizonyos célokra nem 55 alkalmasak. A leírt táptalajon a legtöbb streptococcus nem szaporodik. Az ismertetett eljárás a streptococcusok hővel történő elpusztításával kezdődik. E művelet feltárja a mikroorganizmusokat, és a mikroorganizmusokból feszabaduló számos szennyezés — ame- 60 lyek valószínűleg reaktívak - nehezen távolítható el a végtermékből. Ezért, úgy tűnik, a kapott HA nem lenne alkalmas arra, hogy emlősöknek injekció formájában beadják. Minthogy a HA gyógyászati alkalmazása szüksé- 65 gessé teszi, hogy a HA-t az emlős testébe injektálják — például folyadékhelyettesítés céljából —, igen fontos, hogy az e célra alkalmazott termék olyan tiszta legyen, amennyire csak lehetséges és ne okozzon reaktivitási problémát. A tisztaság ilyen nagy jelentőségű voltát a 4 141 973. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetik. Ez a leírás ultratisztaságú HA készítmény előállítását^ úja le kakastaréjból vagy emberi köldökzsinórból. Úgy tűnik, hogy a tisztaságon kívül a HA termék molekulatömegének szabályozása is fontos. A 4 141 973. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban legalább 750 000-es átlagos molekulatömeget javasolnak, a 4 303 676. számú amerikai szabadalmi leírásban pedig két szabályozott molekulatömegű — egy alacsony és egy magas molekulatömegű - frakció elkülönítését javasolják. Bár Swann közleményéből [Arch. Opthal. 88, 544-548, (1972)] ismert egy nagytisztaságú, azaz 0,05% alatti fehérjetartalmú, nagy molekulatömegű (1 200 000) HA készítmény, nem ismerünk semmiféle ismertetést olyan HA készítményekre vonatkozóan, amelyek egyidejűleg a következő előnyökkel bírnak: 1. mikrobiológiai eredetűek, viszonylag olcsóak, nagy hozammal állíthatók elő, injektáláskor reaktivitásuk kicsi; 2. átlagos molekulatömegük megfelelően magas és közel szabályozott; 3. fehérje- és nukleinsavszennyeződésektől lényegében mentesek. Igen meglepő módon azt találtuk, hogy ilyen termék előállítása lehetséges. A következőkben a termék előállítását, jellemzését és alkalmazását részletesen ismertetjük. A találmány szerint ultratisztaságú, szabályozott molekulatömegű HA-t hialuronidáz-negatív vagy hialuronidáz-gátolt organizmusok tenyésztésével állítunk elő olyan körülmények között, amelyek lehetővé teszik a HA felhalmozódását. A termelt HA-t ezután kiszabadítjuk a sejtekből, majd a fehérjék és a nukleinsavak lényegében teljes eltávolításáig tisztítjuk. Az eljárás egy előnyös változata értelmében a HA-t Streptococcusok C csoportjába tartozó organizmusok, például Streptococcus equi tenyészetből állítjuk elő, előnyösen sejten kívüli fehérjéktől mentes tenyészetből, így a végtermékül kapott steril készítmény átlagos molekulatömege szűk határok között szabályozott, fehérjetartalma 1,25 mg/ml alatti, előnyösen 0,10 mg/ml alatti és nukleinsavtartalma 45 jug/ml alatti, előnyösen 5 /ig/rnl alatti értékű, és például emlősök ízületi nedvének helyettesítésére alkalmazható. Mint azt a következő példák mutatják, a találmány szerint előállított HA termék minden más, a kereskedelmi forgalomban kapható HA terméktől különbözik abban, hogy mikrobiológiai eredetű, hialuronidáznegatív vagy hialuronidáz gátolt törzsek tenyészetéből származik, átlagos molekulatömege szűk határok között szabályozott, és ami igen fontos, lényegében fehérjéktől és mukleinsavaktól mentes és nem tartalmaz kondroitin-szulfátot, amely anyagok nemkívánatos komponensek, ha a terméket állati nedvek helyettesítésére kívánjuk alkalmazni. A „lényegében mentes” kifejezésen 1,25 mg/ml, előnyösen 0,10 mg/ml alatti fehérjetartalmú, illetve 45 jigfml, előnyösen 5 jug/ml alatti nukleinsavtartalmú HA készítményt 2
