192569. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vírusgenomok és származékaik fenntartására és elszaporítására
1 192 569 2 pH (KOH) 5,8, 520 mOs/kg H20, összes anyagot oldjuk és 1000 ml-re kiegészítjük kvarcon kétszer desztillált vízzel. Tenyésztési módszer Az előzőekben megadott táptalajban lévő protoplaszt szuszpenzióból 2,5 ml-t pipettázunk 6 cm átmérőjű műanyag Petri-csészébe és a fentiekben megadott, azonos térfogatú tápközeget - amely 3 % olvasztott agarózt (Agarose-t) „Sea Plaque” (Marine Colloids) tartalmaz - keverünk. Az agarózt tartalmazó táptalaj hőmérséklete semmi esetre sem lehet 40 °C-nál magasabb. A kezelés után a protoplasztok 4 x 104/ml populációsűrűségben !,5 %-os agarózfartalmú géles táptalajba vannak beágyazva. A protoplasztszuszpenzió megdermedése után a gélből részeket (szektorokat) vágunk ki és 10 cm átmérőjű, steril műanyag edényekbe, amely 30 ml, az előzőekben megadott folyékony tápközegbe visszük át és kb. 40 fordulat/perc mozgású rotációs rázógépben állandó sötétségben, 24 °C-on inkubáljuk, 3—4 napos időközben a folyékony tápközeget azonos összetételű, friss táptalajjal egészítjük ki. 14 napos tenyésztés után a tápközeg ozmotikus értékét — a glükóz ozmotikum fokozatos csökkentésével — 3 hét alatt 250 mOs/kg H20-ra csökkentjük. E kezelés során a protoplasztok közel 40 %-a makroszkóposán látható sejtkolóniává fejlődik. 2. példa A Brassica rapa sejtkultúráinak tenyésztése Tápközeg: Nitsch, J. P. és Nitsch, C. (1969), Science 163, 85-87 nyomán módosított: KNO3 950 mg/1 m-Inozit 100 mg/1 NH4NO3 720 mg/1 Nikotinsav 5 mg/1 MgS04'7H20 185 mg/1 Piridoxin-HCl 0,5 mg/1 CaCt2 ' 2H20 220,5 mg/1 Tiamin-HCl 0,5 mg/1 KH2PO4 68 mg/1 Pólsav 0,5 mg/1 FeCl3 -6H20 27 mg/1 Biotin 0,5 mg/1 Na2EDTA 74,6 mg/1 Glicin 2 mg/1 MnS04'1H20 17,25 mg/1 Agár (Difco) 9000 mg/1 H3BO3 10 mg/1 Szacharóz 20000 mg/i Z11SO4 • 7H20 10 mg/i Kókusztej (Gibco) 2,5 mg/1 Na2Mo04 ■ 2.H20 0,25 mg/1 2,4-Diklór-fenoxi-ecetsav 0,25 mg/i C11SO4 ■ 5H20 0,025 mg/1 CT-Naftil-ecetsav 6-Benzil-amino-purin 0,1 mg (l pH (KOH) 5,8, 20 percig 101,325 kPa nyomáson autoklávozzuk. Tenyésztési módszer Az 1. példa sejtkolóniáit, amelyek keresztmetszete egy vagy több rani-t is elérte, a fentiekben megadott, agart tartalmazó táptalaj felületére visszük, és 24 °C-on tartós sötétségben inkubáljuk. Az előzőekben leírt módon a nem fertőzött és a Cauliflower-Mosaic-Virussal fertőzött Brassica rapa növények húszon felüli protoplaszt szériában sejttenyészetté regenerálódnak. 3. példa A vinisszaporodás kimutatása a DNS sejttenyészet radioaktív jelölt DNS-Cauliflower-Mosaic-Virussal történő hidridizációval Vizes oldatok DNS-hibridizdcióhoz Proteináz K 0,1 mg/ml Proteináz K (Merck 24568): 0,1 tömeg% Nátrium-azid 0,1 tömeg% Nátrium-dodecilszulfát (= SDS) Alkálifém-oldat: 0,05 mól/lNaOH 1,5 mól/lNaCl Semlegessó oldat: 3,0 mól/1 NaCl 0,5 mól/1 trisz(hidroxi-metil)-amino-metán-puffer (=Trisz-HCi-puffer), pH = 7,0 Módszer a) A 2 példa sejtkolóniáit egyenként 1—1 ml 2-metoxi-etanolban, 5 órán át szobahőmérsékleten inkubáljuk, b) a 2-metoxi-etanolt elővigyázatosan leszivatjuk és a sejtkolóniákat folyékony nitrogénben megfagyasztjuk, c) a megfagyasztott sejtkolóniákat Eppendorf-csövecskékben porrá homogenizáljuk, d) a porított anyagot 200-200 pl vízben szuszpendáljuk és alaposan összekeverjük, e) 2 percig Eppendorf centrifugában erőteljesen centrifugáljuk, 0 az átlátszó felső részt használjuk a DNS-hibridizációhoz, Hibridizális g) Az átlátszó rész 50-50 pl-ét (1. f) pont) a BRL-dot hibridizációs rendszerbe (a BRL-dothybridisations- Systems, Bethesda Research Laboratories BRL Nr. 1050 MM) szűrőkamráiba visszük, a szűrőket előzőleg benedvesitjük és gyenge vákuum (vízsugárvákuum) is szükséges, h) végül 200-200 jul vizet adunk hozzá és átszűrjük, i) a fentiekben leírt proteináz-K-oldatból 150-150 Ml-t adunk minden egyes kamrához, az egész rendszert műanyag fóliába csomagoljuk és egy éjszakán át inkubáljuk, j) a proteináz-oldatot leszívatjuk,a fentiekben megadott alkálifém-oldat 150-150 /ul-ével pótoljuk, és 15 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk, k) az alkálifém-oldatot leszivatjuk és az előzőekben megadott, semíegessó-oldat 150-150 ju 1-ével pótoljuk és további 10 percig inkubáljuk, l) a semlegessó-oldat leszivatása után kétszer 5 percen át mossuk 150-150 pl nátrium-klorid/-nátrium-dtrátpufferrel ( = SSC: 17,5 g NaCl és 8,8 g Na-citrát/hter H20, a pH-t NaOH-dal 7-re) állítjuk be, m) az SSC leszivatása után a szűrőket 2 órára 80 °C-ra melegítjük, és n) ezt követően radioaktív CaMV-DNS-sel hibridizáljuk, o) a radioaktív jelzett szűrőket filmmel láthatóvá tesszük, p) a sejttenyészetek extraktumai, amelyek CaMV-t, illetve CaMV-DNS-t tartalmaznak, a szűrőn hibridizálődnak a radioaktív jelzett CaMV-DNS-sel és ezáltal a film megfeketedését idézik elő. A BRL-Hybrid-Dot- System egyes kamráiban lévő szűrők megfeketedése vagy meg nem feketedése alapján fotokémiai kezeléssel leolvashatjuk, hogy melyek azok a vizsgált sejtlco-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
