192569. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vírusgenomok és származékaik fenntartására és elszaporítására
1 192 569 2 léniák, amelyek a CaMV-t, illetve a CaMV-DNS-t tartalmazzák. 4. példa A virusszaporodás kimutatása az egészséges növények sejttenyészet-extraktumával történő reinfekciójdval a) A 2. példa egyes sejtkolóniáit 1-1 ml 2-metoxi-etanolban 5 órán át szobahőmérsékleten inkubáljuk, b) a 2-metoxi-etanolt óvatosan lcszivatjuk és a sejtkolóniákat folyékony nitrogénben megfagyasztjuk, c) a megfagyasztott sejtkolóniákat Eppendorf-csövecskékben porrá homogenizáljuk, d) a porított anyagot 200—200 prl-vízben szuszpendáljuk, és alaposan összekeverjük, ezt követően e) 2 percig erősen centrifugáljuk az Eppendorf centrifugában, f) az átlátszó részt a reinfekcióhoz használjuk fel. Reinjékció Szigorú sterilitási feltételek között az egészséges Brassica rapa növény levél színét szilicium-karbiddal (dörzspor, papír) megsértjük és a 4. példa f) pontja szerinti átlátszó résszel inokuiáljuk. A növényeket 3-4 hétig egyéb vírusfertőzés lehetőségének kizárásával neveljük és ezt követően a fellépő vírustüneteket (mozaiktünet, a levélér sávosodás) megvizsgáljuk. A dörzsporral kezelt kontroli-növényeket az inokulált növényekkel azonos feltételek között neveljük. Az egészséges növényeknek az f) szerinti átlátszó résszel történő bedörzsölése után a vírustünetek fellépése vagy elmaradása bizonyíték a sejttenyészetben a funkcióképes CaMV-részecskék jelenlétére vagy hiányára. Az előzőekben leírtak alapján beigazolódott, hogy a sejttenyészetek 5 %-ában - amelyek vírusfertőzött növények protoplasztjaiból fejlődnek - a vírusok nagy tömege képződött. 5. példa Nem fertőzőképes vírusmutánsok felhasználása sejtklónok vektoraiként növény szövetben A Brassica rapa különböző kailuszklónjaiban lévő CaMV-DNS présnedvével az egészséges Brassica rapa növények levélszínét egyenként bedörzsöljük. A növényeket 3-4 hétig egyéb vírusfertőzés lehetőségének kizárásával neveljük és ezután a víiustünetek előfordulását megvizsgáljuk. Ezenkívül a vírus-DNS-t a növényekből izoláljuk. Ha a kiónok 50 %-a fertőzött és a növények, amelyeket a kiónok présnedvével kezeltünk, a CaMV fertőzés szokásos tüneteit mutatják, akkor e növények vírus- DNS-e restrikciós anyagot tartalmaz, amelyek a kezeléshez felhasznált présnedv vírus-DNS-ével azonosak. Ha a kiónok 30 %-a nem fertőzött, és DNS analízise azt mutatja, hogy a vírusgenom deleciókat tartalmaz. Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás vírusgenomok és derivátumaik fenntartására és szaporítására növényi anyagban, amely a vírusgenomokat már tartalmazza vagy olyan növényi anyagban, amely vírusgenomokat nem tartalmaz és a termesztés előtt a vírusgenomokkal önmagában ismert módon fertőzünk, azzal jellemezve, hogy a vírusgenomokat vagy dérivétumaikat tartalmazó izolált protoplasztokat, sejteket vagy szöveteket önmagában ismert táptalajon, amely szükséges alkotórészként makroelemeket, mikroelemeket, vitaminokat, valamely energiaszolgáltató szénforrást, az auxinok és a citokininek osztályába tartozó fítohormonokat, valamint adott esetben gélképző anyagokat tartalmaz, ozmózisos nyomása stabilizált, és amelyben a protoplasztok sűrűsége I/ml és 1 x 106/ml közötti, a pH értéke 5,6 és 6,5 közötti, 7 0 és 42 °C közötti hőmérsékleten tenyésztünk és kívánt esetben a fenti protoplasztokból, sejtekből vagy szövetekből kifejlett növényt nevelünk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tápközegben a protoplasztsűrűség 2 x 104/ml és 6 x 104/ml közötti. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a növényvírusok genomjait vagy azok derivátumait tartalmazó, izolált növényi protoplasztokat, sejteket vagy szöveteket tenyésztünk. 4 Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a protoplasztok, sejtek vagy szövetek növénygenomjába beépülő, genetikai anyaggal rendelkező vírusgenomokat és ezek derivátumait tartalmazó izolált növényi protoplasztokat, sejteket vagy szöveteket tenyésztünk. 5 Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy genetikailag manipulált vírusgenomokat tartalmazó izolált növényi protoplasztokat, sejteket vagy szöveteket tenyésztünk. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy korlátozott patogenitású vírusgenomokat tartalmazó izolált, növényi protoplasztokat, sejteket vagy szöveteket tenyésztünk. 7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vírusgenomokat vagy derivátumaikat tartalmazó, izolált növényi protoplasztokat, sejteket vagy szöveteket 24 °C-27 °C közötti hőmérsékleten tenyésztünk. 8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vírusgenomokat vagy ezek derivátumait tartalmazó, izolált növényi protoplasztokat, sejteket vagy szöveteket valamely önmagában ismert folyékony tápközegbe viszünk, amelyhez gélképző agarózt adunk és megdermedés után szegmentáljuk, a szegmenseket önmagában isméit tápközegben tenyésztjük. 9. Az 1. igénypont szerinti eljárás természetes körülmények között életképtelen vírusmutánsok fenntartására és szaporítására, azzal jellemezve, hogy a vírusmutánsok vín sgenomjait vagy ezek derivátumait tartalmazó izolált növényi protoplasztokat, sejteket vagy szöveteket valarne’y önmagában ismert tápközegben tenyésztünk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 7
