192569. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vírusgenomok és származékaik fenntartására és elszaporítására
1 192 569 2 A találmány szerinti eljárás további előnye, hogy az izolált, növényi protoplasztok, sejtek vagy szövetek vírusgenomokat vagy derivátumaikat tartalmazzák, amelyek a protoplasztok, sejtek és szövetek növénygenomjába vannak beépítve. A vírusok közül különösen a DNS vírusok, mindenekeló'tt a caulünovírusok említhetők meg és ezek közül különösen a Cauliflower-Mosaic-Virus (karfiol mozaik vírus = CaMV). Vírusgénemként a vírus RNS-ből az eredeti vírus DNS és DNS-másolatok (kópiák) említendők. A vírusgenomok genetikailag manipuláltak lehetnek, például patogenitásuk korlátozott lehet, vagy beépített, vírusidegen, genetikai anyagot tartalmaznak. Általában célszerű izolált növényi protoplasztokat, sejteket és szöveteket tenyészteni, amelyek növényi eredetű beépített, vírusidegen, genetikai anyaggal rendelkező vírusgenomokat tartalmaznak, előnyösen egy olyan növényi anyagot, amelynek genomja a vírusgenomokat tartalmazó protoplasztok, sejtek és szövetek genomjától különbözik, vagyis a genetikailag egymástól különböző növények a genetikai anyagok recipienseként és donorjaként működnek. A beépített, vírusidegen, genetikai anyagok hordozóiként mindenekelőtt a DNS-vírusok, előnyösen a caulímovírusok és ezek közül a Cauliflower-Mosaic-Virus (karfiol mozaik vírus) jöhet számításba. A találmány szerinti különösen előnyös eljárás abból áll, hogy a Brassica rapa, például Brassica rapa cv Just Right izolált, növényi protoplasztjait, sejtjeit vagy szöveteit tenyésztjük, amelyek a Cauiíflower-Mosaic-Virus egy növényi, beépített, vírusidegen genetikai információjával rendelkező genomjait tartalmazzák, és amelyek genomja a Brassica rapa protoplasztjainak, sejtjeinek vagy szöveteinek genomjaitól különbözik. A növényi, izolált protoplasztok, sejtek és szövetek kinyerése az ismert módszerekkel vagy azokkal analóg módon történik. Az izolált növényi protoplasztok, amelyek az izolált sejtek és szövetek kiindulási anyagaként is alkalmasak, a növény tetszés szerinti részéből nyerhetők, mint például levelekből, szárakból, virágokból, gyökerekből, pollenből vagy magból. Előnyösen a levélprotoplasztok használhatók fel. Az izolált protoplasztok sejttenyészetekből is nyerhetők. A protoplasztok izolálásának módszere megtalálható például: Gamborg, 0. L. és Wetter, L. R., Plant Tissue Culture Methods c. kötetében (1975), 11-21. oldalak. A növényi anyag feldolgozása és tenyésztése célszerűen a következőkben ismertetett módon történhet, amely azonban nem jelent semmiféle korlátozást. A növényi szerveket - hacsak a kiindulási anyagnál már nem steril sejtkultúráról van szó — sterilezői kell, például etanollal, higany(II)-kloriddal, kalcium-hipoklorittal vagy kereskedelmi forgalomban lévő fehérítőszerrel, és ezt követően steril vízzel alaposan le kell mosni. Minden további kezelést teljesen steril körülmények között kell végezni, ahol a síerilitás követelménye a használt eszközökre és oldatokra is vonatkozik. A szövetek sejtfalainak lebontása enzimatikusan történik, például a celluláz, hemiceJluláz vagy pektináz segítségével, amely a kereskedelemben mikrobiológiai kultúrfiltrátumként kapható és 0,001 %-tól 5 %-ig terjedő koncentrációban rendelhető (ha nincsen más megadva, akkor a következőkben tömegszázalékról van szó). A növénysejtek turgornyomását az izolálás és a hozzákapcsolódó tenyésztés során a táptalaj és az izolálási közeg nagyobb ozmotikus nyomásával kell kiegyenlíteni. Ez az ozmotikusán hatásosabb közegek, mint például a mannit, szorbit, szacharóz, glükóz, kalcium-klorid vagy semleges sóionok egyedüli használatával vagy az egyszerű táptalaj és/vagy egymás közötti kombinációjával történik. Az izolálási közeg és táptalaj ozmotikus értéke célszerűen kb. 200—1000 mOs/kg H20 (Os = Molalitás = az ozmotikusán ható részecske (partikulum) mólja/kg oldószer) között van. Az enzimkeveréket általában 5,2—8,0, előnyösen 5,4 pH értékre kell beállítani. A szövetek — amelyekből célszerű finom metszeteket készíteni (a levelek esetében az epidermisz eltávolítását is lehet alkalmazni) - inkubációja általában 5—40 °C hőmérséklettartományban, többnyire 24 °C-on történik. Az inkubáció időtartama az enzim koncentrációjától, az inkubáció hőmérsékletétől, a szövettípustól, valamint a szcvetdifferenciálódás állapotától függ. Az inkubációs időtartam általában 20 perc és több nap közötti időtartam lehet. Ezt követően a protoplasztokat a fel nem oldódott szövetekből 25—280 mikrométer lyukbőségű szitán elkülönítjük és centrifugálással betöményitjük. A protoplasztok lebegési sűrűségük és az inkubációs - illetve mosóoldat sűrűsége függvényében ülepednek vagy lebegnek. Az ülepedő vagy lebegő protoplasztokat reszuszpendálással és centrifugálással ozmotikusán stabil mosószeri el (például cukoralkohol, cukor, semleges sók oldataival egyedül vagy ezek kombinációjával, és/vagy a tápközeggel való kombinációjával 5,4-6,5 pH tartományban) ismételten mossuk és végül a tápközegbe visszük. Az ezt követő tenyészet fontos tényezője a protoplasztok populációsűrűsége, vagyis a táp közeg milliliterében lévő protoplasztok száma. A populációsűrűség célszerűen I-tői 1 x 106/ml-ig,optimálisan2xl04/ml-től6xl04/miig terjed. A tenyésztés módja változó, általában folyékony tápközeget alkalmazunk vékonyrétegben Petri-csészében, 1 ju -tői 200 /ul-ig terjedő térfogatú csepp- vagy függőcsepptenyészetben, egészen az agar-agarral, agarózzal gélesített tápközegben vagy a szilárdító anyagot tartalmazó táptalaj és folyékony tápközeg kombinációit használjuk. A t myésztés történhet Petri-csészében, multititer lemezen dobozban, Erlenmeyer lombikban, mikrokapiílárisban vagy szövettenyésztő edényekben. Ezek rétegezett, vagy rétegezetlen műanyagból vagy üvegből lehetnek. A tenyésztést általában 7 és 42 °C között, előnyösen 24 is 27 °C között végezzük, amelyet vagy állandó hőmé: sékleten tarthatunk, vagy sorozatszerűen váltogatunk. A fényviszonyokat a tenyésztés során tartós sötétség és 500-5000 Ix tartós fény és fény-sötétség sonenddel váltogathatunk, előnyösen a fény-sötétség váltogatását alkalmazzuk. Jelenleg számos tápközeg áll rendelkezésünkre, amelyek az egyes komponensekben vagy azok csoportjában különböznek egymástól. Minden közeget a következő elv szerint állítottunk össze: szervetlen ionok egy csoportját tartalmazza körülbelül 10 mg/l-tői néhány 100 mg/1 koncentrációban (ún. makroelemeket, mint nitrátot, foszfátot, szulfátot, káliumot, magnéziumot, vasat), a szervetlen ionok egy további csoportját (ún. mikroelemeket, mint a kobaltot, cinket, rezet, mangánt) tartal-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
