192569. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vírusgenomok és származékaik fenntartására és elszaporítására
t 192 569 2 mázzá legfeljebb néhány mg/1 mennyiségben, továbbá számos vitamint (inozitot, fólsavat, tiamint), energia- és szénforrásokat, mint például szacharózt, vagy glükózt, valamint az auxinok és citokininek osztályába tartozó növekedésszabályozó természetes és szintetikus fitohormonokat 0,01-10 mg/1 mennyiségben. A táptalajokat ezenkívül a cukoralkoholok (például maimit) vagy cukor (például glükóz), vagy sóionok (például kalcium-klorid) hozzáadásával ozmotikusán stabilizáltuk és a pH értékét 5,6—6,5-re állítottuk be. A használatos tápközegek részletesebb leírása megtalálható például Koblitz, H., Methodische Aspekte der Zell- und Gewebezüchtung bei Gramineen unter besonderer Berücksichtigung der Getreide, Kulturpflanze XXII., 1974. (93 157. oldalak) c. munkájában. A tenyésztési és inkubációs feltételeknek, mint például a tápközeg és a környezet hó'mérsékletének, a páratartalomnak, a megvilágítás erősségének és tartamának, a táptalajok kiegészítésének, felújításának, vagy azok összetétele változtatásának alkalmazkodnia kell a mindenkori adottságokhoz, mint a protoplasztok fajtájához, a vírusgenomok és származékaik fajtájához, a növényi anyag és/vagy vírusgenomok növekedési és osztódási sebességéhez, a kiválasztódó anyagok mennyiségéhez és más tényezőkhöz. Az izolált, növényi protoplasztokat, sejteket vagy szöveteket megfelelő táptalajon, általában gélképző anyagot tartalmazó táptalajon tenyésztjük. Gélképző anyagként az agarózt eredményesen alkalmaztuk. A táptalaj agaróztartalma 0,4-4 % között van. Az agaróz az agar egyik alkotórésze. A forgalomban lévő agar a semleges agaróz, az ionos agaropektin és a hozzájuk kapcsolódó, számos származékvegyület keverékéből áll. A forgalomban lévő agarózt az agárból ismert eljárással állítják elő. Általában egyes oldalcsoportok megmaradnak, amelyek lényegében a legfontosabb fizikai-kémiai tulajdonságokat, mint a gélképzést, a gélesedést és az olvadáspontot meghatározzák. Az alacsony olvadáspontú és a gélképző agarózt a hidroxi-etil-csoport agarózmolekulába történő utólagos bevitelével állítják elő. Az így módosított agarózt most és a későbbiekben LMT-Agarose (low melting agarose) névvel jelöljük. A megfelelő agaróz preparátumok például a következők: Sea Plaque LMT, LMP, Typ VII, HGT, HGTP, LE Standard LMT vagy Sea-Prep. A vírusgenomokat vagy derivátumaikat tartalmazó protoplasztokat, sejteket vagy szöveteket különböző módon vihetjük a tápközegbe. Ezt úgy végezhetjük el, hogy a vírusgenomokat vagy derivátumokat tartalmazó protoplasztokat, sejteket vagy szöveteket folyékony, meleg tápközegbe visszük, amely gélkápző anyagot tartalmaz és kihűléskor megdermed. Kedvezőbb viszont, ha a vírusgenomokat vagy derivátumaikat tartalmazó protoplasztok, sejtek vagy szövetek szuszpenzióját gélképző nélküli folyékony tápközegbe visszük, majd gélképző anyagot tartalmazó folyékony tápközeget hozzáadva alaposan összekeverjük és utána hagyjuk megdermedni. Különösen jó eredményt lehet elérnhakkor, ha a gélképzőt tartalmazó tápközeget, amelyben a vírusgenomokat vagy derivátumaikat tartalmazó protoplasztok, sejtek vagy szövetek vannak, folyékony tápközeggel vesszük körül. így például a gélképző tápközeg csészékbe, például Petri-csészébe lemezöntéssel történő kitöltése után- mint ahogy a baktériumok és élesztősejtek tenyésztésekor használják — a megdermedés után szegmensekre (részekre) darabolhatjuk és azt a folyékony tápközegbe, előnyösen tápoldatba helyezzük. A szegmensek térfoga- 5 tának aránya a folyékony tápközeghez, illetve a tápoldathoz 1 : 20-tól 1 :100-ig lehet. Ajánlatos folyékony tápközeget a szegmensekkel például rázással rázógépben mozgásban tartani. A géles közeg szegmentációját általában a tápközeg dermedése után azonnal, vagy a tápközeg 10 dermedését követő 4 héten belül, előnyösen 3—8 nap múlva kell elvégezni. Olyan szegmenseket állítunk elő, amelyek nagysága és mérete előnyösen egyforma. Ezek lehetnek szabálytalan, előnyösen szabályos alakúak. Alakjuk például kúp, 15 kocka, oszlop, prizma, szelet és golyó lehet. A szegmensek átlagos átmérője vagy keresztmetszete általában 2—100 mm, előnyösen 2—10 mm. A találmány szerinti eljárásban protoplasztokat, sejteket és szöveteket használunk, amelyek közvetlenül izo- 20 lálásuk előtt vírussal fertőzöttek voltak vagy olyanokat, amelyek izolálásukkor még vírusmentesek voltak, és amelyeket később vírussal mesterségesen fertőztünk. A találmány szerinti eljárás magában foglalja a vírusmutánsok fenntartását és szaporítását, emellett az ilyen 25 mutánsok vagy ezek derivátumainak vírusgenonjait tartalmazó, izolált növényi protoplasztok, sejtek vagy szövetek megfelelő tápközegben való tenyésztését. A vírusmutánsok természetes körülmények között életképtelenek is lehetnek, különösen vonatkozik ez a növény- 30 vírusok mutánsaira. A protoplasztok, sejtek vagy szövetek tartalmazhatják például az ilyen virusmutánsok eredeti vírus-DNS-ét vagy az RNS DNS-másolatát (kópiáját), amelyek természetes körülmények között életképtelenek, vagy a DNS- 35 vírusok megfelelő mutánsait, emellett a DNS-vírusokként elsősorban a caulimovírusok, különösen a Cauliflower- Mosaic-Virus említendők. A találmány tárgyát képezi a regenerált vírusgenomokat vagy derivátumaikat tartalmazó növénysejtek, a nö- 401 vényszövetek vagy egész növények termesztése, amennyi■ ben ezeket az izolált, növényi - ezeket a vírusgenomo: kát vagy derivátumaikat tartalmazó — protoplasztokbóí, : különösen a termesztett növények protoplasztjaiból ál» htjuk elő. 45? Termesztett növényként itt mindenekelőtt a Gramineae, Solanaceae, Compositae, Cruciferae, Leguminosae ) családok jöhetnek számításba, amelyek közül a Crucij ferae családon belül különösen a Brassica nemzetséget f kell megemlíteni, és itt mindenekelőtt a Brassica rapa-t, 50 például a Brassica rapa cv Just Right-ot. Vírusként különösen a növény vírusok említendők. A tenyésztett növénysejtek, növényszövetek, vagy az egész növények tartalmazhatják az eredeti vírus-DNS-t, a vírus-RNS DNS-másolatát (kópiáját) vagy DNS-vírust, 55 elsősorban a caulimovírust és különösen a Cauliflower- Mosaic-Virust. Különösen kiemelendők a Brassica rapa regenerált növénysejtjei vagy szövetei, amelyek a Cauliflower-Mosaic-Virust tartalmazzák. 60 Továbbá a tenyésztett növénysejtek vagy szövetek olyan vírusgenomokat vagy ezek derivátumait tartalmazhatják, amelyek genetikai információt hordoznak, amelyek a növénysejíek vagy szövefek~genomjábaheépülnek, vagy ezek genetikailag manipulált vírusgenomokat vagy 65 ezek derivátumait tartalmazzák, például amelyek pato-4
