192569. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vírusgenomok és származékaik fenntartására és elszaporítására
1 192 569 2 A találmány tárgya eljárás a vírusgenomok és származékaik fenntartására és szaporítására proliferáló növényi anyagban. A genetikailag manipulált vírusok vektorként történő felhasználásával a növényöröklés új genetikai információinak bevitelekor a növényanyag új, vagy javított tulajdonságokkal állítható elő. A világ népességének gyors emelkedése miatt a biológiai kutatás súlypontját a növényanyag genetikai befolyásolása képezi. A kutatás egyrészt alternatív, reprodukálható élelmiszereket, energia- és nyersanyagforrásokat keres, mint előnyös tulajdonságokkal rendelkező új növény-, különösen hibridfajtákat, amelyek kórokozókkal (mint növénypatogén rovarokkal, gombákkal, baktériumokkal, vírusokkal stb.), az időjárási vagy termőhelyi behatásokkal (mint forrósággal, hideggel, széllel, talajállapottal, nedveséggel, szárazsággal stb.) szemben fokozottan rezisztensek, vagy a levelekben, magvakban, gumókban, vagy gyökerekben, szárakban stb. megemelt tartalék- és készle tanyagképzéssel rendelkeznek. Másrészt az értékes biomassza keresése mellett nő a gyógyászatban felhasználható növényi hatóanyagok és származékaik, mint az alkaloidok, szteroidok és más hasonló anyagok iránti igény. Ezeknek a hatóanyagoknak a hozama igen csekély a természetes előfordulású növényekben, a nagyobb hozam alternatív úton, mint gépmanipulált növényfajták extrakcíójával hozzáférhetővé tehető. Ezért a növények célirányos manipulációjának gyakorlati lehetőségei iránt fokozott az érdeklődés. E cél elérésének egyik útja az idegen gének átvitele izolált növénysejtekbe, a genetikai anyag replikációja és expressziója, valamint azok eiszaporítása és fenntartása a kiinduló sejtből sejtosztódással képződő leánysejtekben. Ilyen leánysejtek egysejt és szövettenyészet vagy egész növény formájában állíthatók elő. Az osztódó növényseiteknél olyan irányzat figyelhető meg, hogy a vírusok behatolását, a vírusok élet- és szaporodóképességét gátolni vagy teljesen lekötni képesek. Így például ismert, hogy a karfiol mozaik vírus (cauliflower mosaic viius = CaMV) egy növény differenciált (állandósult) sejtjeiben szaporodni képes és minden további állandósult sejtet megtámadni képes, ugyanakkor a növekedési centrumot vagy a merisztémát, vagyis az itt osztódó sejteket nem fertőzi meg. így a vírusfertőzött növényből merisztéma tenyészettel vírusmentes növény állítható elő. Ezért az volt várható, hogy a vírusoknak mint új genetikai információk vektorainak a bevitele nem vezet genetikailag módosított növényanyaghoz, a vírusok az osztódó növényi anyagba nem jutnának el, vagy ott tönkremennének, vagy a genetikai anyagot, amelyet a karfiol mozaik vírus (cauliflower mosaic virus) az osztódó növénysejtekbe juttat, a növénysejtek öröklődéskor nem vennék föl vagy rcplikációhoz nem jutnának el. A vírusoknak vektorokként való bevetésével a növényöröklés átalakítása és a növényi kiindulási anyaggal genetikailag azonos utódok előállítása céljából szükséges a vírusokat tenyészteni anélkül, hogy önszaporodásuk és az új gazdasejtbe történő behatolásuk képességét elveszítenék. Azt találtuk, hogy a vírusgenomok vagy származékaik tenyészthetők osztódó növényi anyagban és elértük a virusgenomok vagy származékaik beépítését a növényi genomba. A találmány eljárás a vírusgenomok és származékaik fenntartására és szaporítására osztódó növényi anyagban. Ez az eljárás abból áll, hogy a vírusgenomokat és származékaikat tartalmazó izolált növényi protoplasztokat, sej- 5 teket vagy szöveteket megfelelő táptalajon tenyésztjük. A tenyésztés az egész növény újraképződésével zárul. Az így fenntartott növények némely esetben rezisztenciát mutatnak a további vírusfertőzésre (cross-resistance). A találmány szerinti eljárás keretében lehetséges nem 10 fertőző, természetes körülmények között nem életképes vírusokat (defektes vírusokat) vagy azok genomjait felhasználni, amelyeknek nagy replikációs rátájuk van és lé- ' nyegében a beépített genetikai információ nagysága semmiféle korlátozást nem mutat, emellett az ilyen vírust 15 vagy genomjait tartalmazó növények betegségtünetet nem mutatnak. Ily módon a defektes vírusokat a genetikai információk vektoraként nagyon előnyösen lehet alkalmazni. Továbbá lehetséges defektes vírusokat vagy azok genomjait tartalmazó protoplasztokból, sejtekből 20 vagy szövetekből egész növényeket regenerálni, amelyek a patogén vírusokkal szemben rezisztensek. A virus-DNS sűrűsége a fertőzött kallusz sejtjeiben nagyon nagy és úgy tűnik, hogy messzemenően határtalan. A virus-DNS itt szabadon, nem pedig fehérje (pro- 25 tein) köpennyel burkoltan fordul elő. A találmány keretében az alábbi definíciók érvényesek: Vírusgenomok: Egy vírus genetikai információinak formái: eredeti DNS 30 eredeti RNS egy átirat (transzkripció) DNS Egy vírusgenom származéka (derivátuma): deleciók (letörés, kitörés) 35 mutánsok új kombinációk kombinációk más génanyaggal Protoplaszt: izolált, sejtfal nélküli növényi sejt,amely sejtkultúrává vagy teljes növénnyé törtébe nő regeneráló képességgel rendelkezik Sejttenyészet: A sejtek szaporodó tömege nem differenciált (homogén) állapotban. A találmány szerinti eljárás kiinduló növényanyagaként, különösen izolált pro toplasztokként mindenekelőtt 45 termesztett növények használatosak. A termesztett növények közül ezek mindenekelőtt a Gramineae, a Solanaceae, a Compositae, a Cruciferae és Leguminosae családok jöhetnek számításba. A fent nevezett csoportok képviselőjeként a Gramineae 50 esetében búza, rozs, árpa, zab, rizs, kukorica, köles, cukornád, a Solanaceae esetében burgonya, paradicsom és dohány, a Compositae esetében napraforgó, saláta (Lactuca sativa), endivia (Cichorium endivia) és kamilla (Matricaria), a Cruciferae esetében különböző káposzta- 55 és répafajok, mint olaj- és fűszernövények és a Leguminosae esetében szója, Lupinus, csillagfürt, lucerna, borsó, bab és földimogyoró nevezhetők meg. A Cruciferae családból főleg a Brassica nemzetség említésre méltó, amelyhez például a repce, a réparepce, 60 tariórépa, a fekete és fehér mustár, valamint a káposzta, répafajok tartoznak. Itt különösen a Brassica rapa cv Just Right nevezhető meg. A találmány egyik előnyös eljárása szerint olyan izolált növényi protoplasztokat, sejteket vagy szöveteket 65 tenyésztünk, amelyek a növényvírusok genomjait, vagy azok derivátumait tartalmazzák. 2
