192429. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nagy tisztaságú malát-dehidrogenáz és/vagy laktát-dehidrogenáz enzim előállítására
1 2 A találmány tárgya eljárás nagy tisztaságú, reagensként elsősorban laboratóriumi diagnosztikai célokra felhasználható malát-dehidrogenáz-enzim (a továbbiakban: MDH) és/vagy laktát-dehidrogenáz-enzim (a továbbiakban: LDH) előállítására. Ismert, hogy a szérum transz.aminázok, köztül a glutamát-oxálacetát-transzamináz (GOT) és a glutamát-piruvát-transzamináz (GPT) aktivitásának mérése igen fontos eszköz a szív- és májbetegségek diagnosztikájában, valamint bizonyos gyógyszerek, elősorban a kontraszeptivumok hatásának követésében. A szervezetben a glutamát-oxálacetát-transzamináz cs a glutamát-piruvát-transzamináz a következő reakciókat katalizálja: I. reakció: L-as/partát + 2-oxo-glutarát GOT L-glutamát + axálacetát II. reakció: L-alanin + 2-oxo-glutarát GPT L-glutamát + piruvát A GOT- és GPT-aktivitás mérésére több módszer ismeretes, amelyek közül a spektrofotometriás mérési eljárások bizonyultak a legmegbjzhatóbbaknak. A spektrofotometriás mérési eljárások a fenti reakciókon alapulnak, és olyan segcdenzimeket használnak fel, amelyek hatására a reakcióban képződő oxálacetát, illetve piruvát azonnal a keletkezés sebességének ütemében el is fogy. A GOT-aktivitás mérésénél segédenzimként a malát-dehidrogenáz-enzimet alkalmazzák nikotinamid-adenin-dinukleoitid (NAD+) függő reakcióban. A módszert eredetileg Karmen írta le (J. Clin. Inverst. 34, 131 /19550, az alapeljárást azonban többször módosították A módosítások oka az volt, hogy az oxálacetát-szubsztrátum s- többnyire a dekarboxilázszennyezés miatt - a reakció során piruváttá alakulhat. Az így előálló mérési hiba kiküszöbölésére a inalát-dehidrogenáz segédenzim mellett a mérőrendszerhez laktát-dehidrogenáz segédenzimet is adnak, amely a piruvátot NADH (nikotinamid-adenin-din uktleoüd, readukált forma) oxidálása közben laktatta alakítja, így biztosított, hogy a glutamát-oxálacetát-transzamináz (GOT) által katalizált reakció terméke maradéktalanul redukálódjon, és azzal ekvivalens mennyiségű NADH oxidálódjon. A Nemzetközi Klinikai Kémiai Bizottság ajánlása (Clinical Chemistry 53, 887 /1977/) a GOT- és GPT-aktivitás meghatározásában felhasználható segédenzimeg (malát-dehidrogenáz és laktát-dehidrogenáz), szubsztrátumok (L-asztartát és L-alanin) és a koenzim (NADH) minőségével szemben igen szigorú követelményeket támaszt. A malát-dehidrogenáz (MDH) és laktát-dehidrogenáz (LDH) segédenzimek GOT-szennyezettsége nem lehet nagyobb 0,005%-nál, glutamát-dehidrogenáz (GLDH) szennyezettsége pedig nem haladhatja meg a 0,003%-ot. Ennek a követelménynek a kereskedelemben kaható malát-dehidrogenáz és iaktát-dehidrogenáz enzimek nem tudnak elget tenni. Ugyanis a felhasználsukkal készült reagens vérszérum hozzáadása nélkül is irreálisan magas aktivitást mutat, amely nyilvánvalóan meghamisítja a klinikai eredményeket. A találmány célja tehát olyan eljárás kidolgozása amellyel egyszerű technológiával nagy hatékonyságú tisztítás érhető el. Kísérleteink során abból indultunk ki, hogy az MDH, GOT, GPT és GLDH enzimek tisztítása során az alapvető kérdés a mitochonriális és citoplazmatikus formák elválasztása. Miután a kereskedelemben kapható a GOT, illetve GPT klinikai kémiai reagensek készítése szempontjából t.isztítatlan MDH enzimet Mehler és munkatársai módszerével (J. Bioi. Chem, 179, 961 /1948/) mitochondrjális formában állítják elő, a szennyező enzimek is ebben a formában találhatók. Korábbi megfigyelések (Clinica Chimjca Acta 15, 337 /1967/} az mulatták, hogy a mitochondriális MDH, illetve GOT, GPT, GLDH cellulóz-alapú arűoncserélö gyantákon nem vagy csak igen gyengén kötődnek. Meglepő módon azt is tapasztaltuk, hogy az általunk alkalmazott hígítási cs pH-körüimények mellett a szennyező mitochondriális eredetű enzimek megkötődnek az ioncserélő gyantán, a tisztítani kívánt MDH és LDH viszint nem Az LDH amelynek nincs mitochondriáüs formája - tisztítása során a szennyező enzimek lehetnek citopl.azmatikusak és nűtochondrjálisak is, és ezek közül az általunk alkalmazott körülmények között az utóbbiak - a citoplazmatikus formák mellett — szent megkötődnek a gyantán. A találmány tárgya tehát eljárás nagy tisztaságú malát-dehidrogenáz és/vagy alktát-dehidrogenáz enzim előállítására. A találmány értelmében úgy járunk el, hogy a szennyezett enzitn(ek) vagy az enzim(ck)et tartalmazó fehéije-preparátum vizes oldatát 6,5 cs 7,5 közötti pH-értékű pufferoldat jelenlétében cellulóz-vágy dextrán-alapú anioncserélő gyantával hozzuk érintkezésbe, majd a folyadékfázisból, ismert módon elkülönítjük a tiszta enzim(ek)eí. Az oldat a tisztítandó enzimet vagy enzimtartalmú fehérje-preparátumot rendszerint 2—15 mg/ml, célszerűen 8—12 mg/ml koncentrációban tartalmazhatja. Pufferoldatként előnyösen 7-es pH-értékű vizes foszfátpuffer-oldatot, célszerűen 0,008 mólos nátrium-foszfát-pufferoldatot alkalmazhatunk. Cellulóz- vagy dextrán-alapú ioncserélő gyantaként például Whatman DE-52 típusú gyantát használhatunk fel. Eljárhatunk úgy, hogy a vizes oldatot és a gyantát összekeverjük, majd a szuszpenziót - célszerűen legalább 20 percig — állni hagyjuk, és ezután centrifugálással, dekantálással vagy szűréssel elválasztjuk a gyantát a folyadékfázistól. Ebben az esetben az oldat és a gyanta térfogataránya 3:1 — 1:3, előnyösen 1:1 lehet. Eljárhatunk azonban úgy is, hogy a tisztítandó enzimet vagy fehérje-preparátumot t artalmazó oldatot cellulóz- vagy dextrán-alapú anioncserélő gyantával töltött oszlopon bocsátjuk át, és az eluátumból különítjük el a tisztított enzimet. Az eluálást nátrium-klorid-oldattal végezhetjük. A találmány szerinti tisztítási eljárással az enzimek GOT-, GPT- és GLDH-tartalma jelentősen csökkenthető, ugyanakkor nő a preparátum malát-dehidrogenáz, illetve laktát-dehidrogenáz aktivitása. A találmány szerinti eljárással tisztított enzimekből készített GOT- és GPT-reagensek stabilabbak a kereskedelemben jelenleg kapható legjobb minőségű GOT- és GPT-reagenseknél: +4 °C-on tárolva 5 napon át semmilyen változást nem szenvednek. Az eljárás további előnye, hogy egyszerűen és igen gyorsan végrehajtható, és a felhasznált anioncserélő gyanta regenerálás után ismételten felhasználható. A találmány szerinti eljárás az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példákban részletesen ismertetjük. 92.429 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
