192429. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nagy tisztaságú malát-dehidrogenáz és/vagy laktát-dehidrogenáz enzim előállítására
1 2 I. példa Malát-delűdrogenáz-enzim tisztítása (a) Az ioncserélő gyanta előkészítése: l g Whatman DE-52 anioncserélő gyantát 15-30 ml 0,008 mólos nátrium-foszfát pufferoldatban (pH« « 7) ekvilibr.ilunk, mindaddig, amíg felülúszó pH-ja már nem változik, azaz értéke 7 marad. Ez többszöri puffercserével és közben legalább 10 -20 perces állásidők beiktatásával érhető el. Állás közben a gyantát néhányszor felkeverjük A műveleteket szobahőmérsékleten végezzük. A teljes ekvilibrálódás után a gyantát azonnal felhasználhatjuk, vagy 0,03= toluolt tartalmazó pufferoldatban *4 u-on táolhatjuk. Ilyen körülmények között a gyanta hónapokon át tárolható. Felhasználás előtt a gyantát +4 °C-ra hűtjük, és meghatározzuk a gyanta nedves térfogatát. (b) Malát-dehidrogenáz-enzim-oldat készítése: A tisztítandó enzim - amely a J. Bioi. Chem. 179, 961 (1948) közleményében leírtak szerint készült - 5071 -os licerines oldat formájában, ammónium-szulfátos precipitation formájában, vagy liofilizált állapotban áll rendelkezésünkre. A glicerines oldatot a találmány szerinti tisztítási művelet előtt 0,008 mólos foszfátpuffer-oldat (pH = = 7,0) ellenében dializáljuk, midaddig, amíg a licerin-tartalom 2 mmól/l érték alá csökken. A dializáláshoz húsz-szoros térfogatú pufferoldatot használunk fel, és a pufferoldatot 3 óránként cseréljük. Négyszeri oldatcsere után a glicerin mennyisége az előírt érték alá csökken. Az ammónium-szulfátos pre pit it át untot a találmány szerinti tisztítás előtt desztillált vízben oldjuk, és a vizes oldatot az előzőekben ismertetett módon dializáljuk mindaddig, amíg a dializáló pufferoldatban ammónia Ncssler reagenssel ntár nem mutatható ki. A liofilizált enzimet a találmány szerinti tisztítás előtt desztillált vízben oldjuk. (c) Az enzim tisztítása: Az (a) lépésben ismertetett módon 0,008 mólos nátrium-foszfát pufferoldattal egyensúlyba hozott Whatman DE-52 anioncserélő gyantáról centrifugálás sál, majd vákuumban végzett szűréssel eltávolítjuk a pufferoldat fölöslegét, és a nedves gyantát azonos térfogatú, 10 mg/ml koncentrációjú, a (b) lépésben közöltek szerint elkészített enzimoldattal keverjük össze. A keveréket fél órán át állni hagyjuk,eközben 3 4-szer megkeverjük. Állás után a gyantát 3000 fordulat/perc sebességgel, 10 percig végzett centrivugálással elkülönítjük a felülúszótól. A tisztított maiát-dehidrogenáz-enzimet a felül úsz.ó tartalmazza. Minthogy a malát-dehidrogenáz-enzim oldott állapotben aktivitásából gyorsan veszít, a fenti műveleteket célszerűen +4 IjC-on végezzük. A tisztított enzimei liofilizálással különítjük el a felülúszótól. A tiszta enzim 20 °C-on 1 hónapig tárolható. A kapott tisztított enzim malát-dehidrogenáz aktivitása a kiindulási 2634 NE/mg-ról 3684 NE/mg-ra nőtt. szennyező GOT-aktivjtása 1300 NE/l-ről 130 NEjl-re, GLDH-aktivitása 10,7 NE/l-ről 2,1 NE/l-re csökkent. 1 NE/1 MDH-aktivitásra vonatkoztatva a tisztított enzim GOT-akti vitása 2,5 x 10'4 NE/1 volt. (d) Az ioncserélő gyanta regenerálása: A gyantát megkötött fehérjéket 0,2 mól/1 nátrium-klorido! tartalmazó 0,2 mólos foszfátpufferrel (pH ■ 7) leoldjuk, majd a gyantát 15 térfogatrész desztillált vízzel ötször mossuk. A mosófolyadékot szűréssel vagy dekantálással távolítjuk el. Ezután a gyantát 15 térfogatrész 0,5 mólos vizes sósavoldattal keverjük össze, legalább 30 percig állni hagyjuk, majd G-l-es üvegszűrőre töltjük, és desztillált vízzel addig mossuk, amíg a szűrlet pH-ja el nem éri a 4,0 értéket! Ezután a gyantát 15 térfogatrész 0,5 mólos vizes ndtrium-hidroxid-oldattal keverjük össze, a keveréket legalább 30 percig állni hagyjuk, majd üvegsz.űrőn desztillált vízzel mossuk núndaddig, amíg a szűrlet pH-ja semleges nem lesz. Az utóbbi műveletet megismételjük. 2. példa Laktát-dehidrogenáz-enzim tisztítása Mindenben az l. példában közöltek szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy laktát-dehidrogenáz-enzum oldatból indulunk ki. A tisztítani kívánt enzimet például az Acta Physiol. Acad. Sei. Hung. 20, 339 (1961) közleményben leírt módon állítjuk elő. Az enzimoldatot az 1. példa (b) lépésében közöltek szerint készítjük. A tisztított enzim laktát-dehidrogenáz aktivitása a kiindulási 500 NE/mg-ról 550 NE/mg-ra nőtt, GPT-aktivitása 240 NE/l-ről 130 NE/l-re, GOT-aktivitása 84 NE/l-ről 76 NE/l-re csökkent, a GLDH-aktivitás a méréshatár alatt volt . I NE/1 LDH-aktivításra vonatkoztatva a tisztított enzim GPT-aktivitása 1,6 x I0‘4 NE/l-ről 1,1 x 10'4 NE/l-re csökkent. 3. példa Malát-dehidrogenáz és/vagy laktat dehidrogenáz enzim tisztítása Mindenben az 1. példában közöltek szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy a tisztítandó enzim-oldat és a gyanta keverékét 1 órán át tartjuk *■4 °C-on, majd a felülúszót centrifugálás helyett dekantálással különítjük el. 4. példa Malát-dehidrogenáz és/vagy laktát-dehidrogenáz enzim tisztítása Mindenben az 1. példában közöltek szerint járunk el, azzal az eltéréssel, hogy centrifugálás helyett a gyantaszuszpenziót 0,003 -0,009 pórusát mérőjű üvegszűrőre öntjük, és a folyadékfázist vákuumban végzett szűréssel különítjük el. Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás nagy tisztaságú malát-dehidrogenáz és/ vagy laktát-dehidrogenáz enzim előállítására, azzal jellemezve, hogy a szennyezett enzim(ek) vagy az enzim(ek)et tartalmazó fehérje-preparátum vizes oldatát 6,5 és 7,5 közötti pH-értékű vizes pufferoldat jelenlétében cellulóz- vagy dextrán-alapú anioncserélő gyantával hozzuk érintkezésbe, majd a folyadékfázisból ismert módon elkülönítjük a tiszta enzím(ek)et. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal j-e 1 - lemezve, hogy vizes puffcroldatként 7-es pH-értékű foszfátpuffer-oldatot, célszerűen 0,008 mólos nátrium-foszfát pufferoldatot használunk fel. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tisztítandó enzimet vagy enzimtartalmú fehérje-preparátumot 2-15 mg/ml, előnyösen 8-12 mg/ml koncentrációjú oldat formájában használjuk fel. 192.429 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
