192388. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nurzeotricin előállításáraa, valamint só alakjában vagy adszorbeált állapotban történő kinyerésére
1 2 anyagként megadva), a 4. ábra a pH-érték, valamint a glükóz-, illetve armnónium-nitrogén-koncentráció időbeli alakulását mutatja, az S. ábra az ammóoium-hidroxld adagolásának ütemét, valamint a foszfát és az oldott oxigén koncentrációjának időbei ialakulását mutatja. A 6. ábra a távozó levegő oxigén- és széndioxid-tartalmának, valamint a fajlagosan keletkezett hömenynylségnek időbeli alakulását ábrázolja, míg a 7. ábra a fajlagos termék;-képzödés és a fajlagos növekedés ütemét szemlélteti. A fermentálás során a közvetlen foszfátadagolás vagy glükózadagolás formájában megvalósuló szabályozástechnikai beavatkozást szakaszosan, kézi erővel végezzük, az ammónium-hidroxid adagolási üteme alapján. A pH megengedett‘tartománya 6,2 ± 0,05, Így az alsó határ 6,15, és ezt az értéket a fermentálás 38. órájában éljük el. A foszfát közvetlen adagolásához steril vizes KH2 P04-oldatot használunk. Az első 32 órán át anynyit adagolunk az oldatból, hogy — az anyagcsere aktivitásának serkentése céljából - a tenyészet literenként összesen 42 mg foszfátos foszfort tartalmazzon. A választott pH-névérték és a tápközeg pufferolási állapota által meghatározott időpontban, jelen esetben a 38 órában kezdődik a 25%-os ammónium-hidroxid adagolása. Az adagolási ütem gyorsulásának csökkenése (az 5. ábrán felismerhető, hogy a görbe veszít meredekségéből) a 47. és 48. óra, Sietve az 53, és 54. óra között közvetlen foszfátadagolást vált ki 8,5 mg foszfátos foszfor/Uter tenyészoldat mennyiségben. Az ammónium-hidroxid adagolási üteme a 62. órában eléri a maximális értéket, majd ettől kezdve csökkeni kezd, annak megfelelően, hogy a foszfátok közvetlen adagolását a foszfátok szubsztrátumból való felszabadulása váltja fel. A következő 20 órán át a fermentálás az optimális adagolási ütem, azaz mintegy 230 [ml/m3/ó] 25%-os ammónium-hidroxid mellett magy végbe. Az adagolt ammónium-hidroxid elegendő ahhoz, hogy a nitrogén koncenctrádóját az élettanilag kedvező tartományon belül tartsa, ezért további nitrogénfbrrást nem adunk a tenyészethez. A szénforrás szabályozása szintén az ammónium-hidroxid adagilási üteme alapján történik. A második foszfátadag után az arpmónium-hidroxid adagolási ütemének gyorsulása erősen csökken, ezt jelnek tekintjük glükóz adagolására 48 g/1 mennyiségben (56. óra). A 95. óra elteltével 18 g/1 mennyiségű glükózt adagolunk. A foszfát közvetlen adagolása az oldott oxigén konceAtrádójára nem hat ki. A hőfejlődés és a távozó levegő összetétele a fermentálás fázisait mutatja. A két paraméter folyamatos megfigyelése alapján szubsztrátum hiányok elkerülhetők. A tenyészoldat végső termékszintjét (10,5 ml/rnl) úgy éljük el, hogy a termék képződésének fajlagos ütemét 45 órán át 8,10'3 (óra'1) értéken tartjuk. Az adagolt glükóz maradéktalanul hasznosul, és a biomassza mennyisége nem haladja meg a feldolgozhatóság által szabott szintet. 8. példa Az antibiotikum elkülönítésére 750 liter tenyészléhez (2900 f/g/ml nurzeotridn bázis) 7,6 kg oxálsav telített vizes oldatát adjuk. Az oldat pH-értékét ammónium-hidroxiddal 4,2-re állítjuk, az oldatot rövid időre 70 °C-ra melegítjük, a szilárd fázist szeparátorban elválasztjuk, a szűrletet ammónium-hldroxiddal semlegesítjük, lebegőanyagok eltávolítása céljából újra szeparáljuk, majd 25 liter/ó sebességgel lentről felfelé két, egyenként 5 liter Na-formájú Wofatit CP ioncserélővel töltött oszlopon keresztül vezetjük. Utána mindegyik oszlopot először 30 liter vízzel, utána 20 liter 0,1 n ecetsavval, majd 15 liter vízzel mossuk, és ezt követően az antibiotikumot (oszloponként) 20 liter 0,5 n kénsavval, majd 10 liter vízzel eluáljuk. 3,0 alatt pH-jú eluátumokat OH-formájú Wofatit AD 41 ioncserélővel semlegesítjük. Az I. oszlop eluátumához (32,8 liter) keverés közben addig adagolunk diammónium-hidrogén-foszfát-oldatot és ammónium-hidroxid-oldatot, míg 7,5-7,8 pH mellett további csapadék már nem keletkezik. A kivált szervetlen foszfátokat szűréssel eltávolítjuk és a tiszta szűrletet sómentesítés céljából 20 l/ó sebességgel 10 liter H-formájú Wofatit KP 16 ioncserélő gyantán át szűrjük. Az ioncserélő gyantákat 20 1 vízzel mossuk, a vizet hozzáadjuk a szűrlethez, a mintegy 55 liter folyadékot vákuumban 30—40 °C-on 6,5 liter térfogatra betöményítjük, majd 100 g aktívszénnel derítjük. A szűrletet kénsav-oldattal 4,0 és 4,5 közötti pH-értékre savanyítjuk, majd keverés közben 75 liter metanolba csepegtetjük. A nurzeotridn amorf csapa" dék alakjában kiválik. A csapadékot szűrjük, metanollal mossuk és vákuumban 40 °C-on szárítjuk. A II, oszlop eluátumát hasonlóképpen dolgozzuk fel. Hozam: I. oszlop: 745 g nurzeotricin-szulfát faj p: -27,5° (c = 1, víz), szulfáthamu; tömény kénsawm végzett roncsolás után megmaradt hamu 2,2% biológiai hatékonyság: 687 Wg/mg II. oszlop: 579 g nurzeotridn-szulfát szulfáthamu: 2,0% biológiai hatékonyság: 470 Mg/mg 9. példa A 8. példa szerint tisztított, majd sómentesített eluátum 9,6 literjét vákuumban 30-40 °Con 440 ml térfogatra bepároljuk, a koncentrátumot 12 g aktívszénnel derítjük, szűrjük és kénsavval pH 6,0-ra savanyítjuk. A koncentrátumot kétféleképpen dolgozzuk fel. Porlasztvaszárítás 220 ml koncentrátumot (szárazanyagtartalom 33%) Mini Spray Dryer Büchi 190 márkájú laboratóriumi porlasztó berendezésben porlasztva szárítunk, a belépő levegő hőfoka 165-175 °C, a kilépő levegőé 85-90 °C. Hozam-58,4 g nurzeotridn-szulfát fa]z p = -32,8° (c = 1, víz), szulfáthamu: 0,4% víztartalom: 6,0% mikrobiológiailag meghatározott hatékonyság: 980 Mg/mg Elemanalízis: számított, %;C 36,87 H 6,48 N 16,99 S 5,64 talált, %: C 37,01 H 6,66 N 16,99 S 5,71 Fagyasztvaszárítás 220 ml koncentrátumot TG-5 típusú fagyasztvaszárító berendezésben (gyártó cég: VEB Hochvakuum Dresden) szárítjuk. A termék kezdeti hőmérséklete -20 °C, a folyamat végén a nyomás 3-,99966 Pa Hozam: 71,5 g nurzeotricin-szulfát mikrobiológiailag meghatározott hatékonyság: 994 Hg/mg„ fa]'“p: -34,2 (c = 1, víz), víztartalom: 3,0% 192.388 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 8
