192388. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nurzeotricin előállításáraa, valamint só alakjában vagy adszorbeált állapotban történő kinyerésére
1 2 192.388 ,400-400 ml mennyiségben 2,5 Uteres üvegekbe töltünk, majd a Streptomyces noursel Z1MET 43716 jelű törzs egyik variánsának micéUum-szárítmányáböl nyert 0,5 ml vizes szuszpenzióval inokuláljuk. Az oltótenyészetet lengő rázóasztalon 29 °C-on 48 órán át fermentáljuk. Az így kapott első előtenyészet 800 ml-jével beoltjuk a második előtenyészet azonos összetételű, 100 Uter mennyiségű, 120 6C-on 45 percen át sterilizált tápközegét. A második előtenyészetet 240 Uter térfogatú, nemesacélból készült, fermentorban 28-29 °C-on 40 órán át fermentáljuk (fordulatszám: 240 perc"1, levegőztetés: 1 tf-rész levegő 1 tf-rész fermentlére percenként). A termelő tenyészet (főkultúra) kialakítása céljából 42Ö0 liter térfogatú, nemesacélból készült fermcntorokba 2500-2500 liter tápközeget töltünk, amelynek összetétele az alábbi: 62,5 g kukoricakeményítő, 2,5 g glükóz, 16 g extrahált szójadara, 11 g (NH4)2 S04, gUkol, csapvíz ad 1000 ml. Az egyik fermentorba a fentieken kívül még 0,5 g ZnS04. .7H20 cinksót, a másodikba 0,1 g Fe2(S04)3 vasszulfátot adagolunk. Sterilizálás előtt a pH-értéket 6,2-re áUítjuk. A glükóz nélküli tápközeget közvetlenül bevezetett gőzzel 120 °C-on 15 percen át sterilizáljuk., A 29 cC-ra lehűlt közeghez steril körülmények között hozzáadjuk az 50%-os vizes oldat alakjában külön sterilizált glükózt. Beoltás előtt a tápközeg pH-ját kénkénsav-oldattal 6,8 ± 0,1 értékre állítjuk. A termelő tenyészeteket 4 tf% inokulummal (második előtenyészettel) beoltjuk, majd 29 °C-on 140 órán keresztül fermentáljuk. Fermentálás közben a keverő fordulatszáma 180 perc. 0,03 MPa túlnyomás mellett a 0-20. órában 1 térfogat tény észlére . számítva 0,5 tf-rész levegővel, a 20. órától kezdve 1 tf-rész levegővel levegőztetjük a tenyészetet. Amikor a pH elérte a 6,0 ±0,1 értéket, 25%-os ammónium-hidroxid-oldattal állandóan ezen az értéken tartjuk. A tenyészoldatokban biológiai teszttel az alábbi nurzeotridn-koncentrációkat mértük meg. mintavétel nurzeotricin koncentrációja mg'tnl időpontja (.Jk óra) " ZnS04.7H20 Fe2(S04)3 92. 116. 140. 4,9 5,1 7,1 6,8 8,3 8,0 6. példa Oltóanyag előállítása céljából 400-400 ml sterilizált tápközeget (15 x extrahált földimogyoró morzsa, 10 kukoricalekvár-szárítmány, 40 g maltóz, 5 g ammónium-szulfát, 6 k kalcium-karbonát, csapvíz ad 1000 ml) tartalmazó 2,5 literes üvegekbe a Streptomyces noursei ZIMET 43716 törzs egyik variánsának micéllumából készült szárítmány 0,5 ml vizes szuszpenzióját adjuk és a tenyészeteket 29 °Con lengő rázóasztalon 48 órán át fermentáljuk. A kapott első előtenyészet 800 ml-ével a második előtenyészet azonos összetételű, 150 Uter térfogatú, gőzzel 120 °C-on 30 percen át sterülzált tápközegét oltjuk be, 240 literes acélfermentorban 28-29 °C-on 40 órán át fermentáljuk, 240 perc'1 fordulatszám mellett 0,03 MPa nyomású levegő 1 tf-rész tenyészlére számított percenként 1 tf-részével levegőztetve. A termelő tenyészethez 720 Uter térfogatú, nemesacélból készült fermentort alkalmazunk, amelybe kukoricakeményítő, 25 g extrahált földimogyoró 5 morzsa, 10 g kukoiicalekvár-szárítmány, 10 g ammónium-szulfát, 5 g'krétapor, 3 g napraforgóolaj, csapvíz ad 1000 ml. SteriUzálás előtt a pH-értéket 6,8—7,0- ra állítjuk. A tápközeget 120 °C-on 30 percen át steriüzáljuk. Oltóanyagként a tápközegre számítva 5 tf% meny> 0 nyiségű második előtenyészetet adunk mindegyik fermentorba. Fermentálás alatt járulékosan két ízben 30-30 g kukoricakeményítőt adagolunk 30%-os szuszpenzió alakjában (amelyet kukoricakeményítő vizes szuszpendálása és a szuszpenzió amlloUtikus 1 c bontása, például sörgyári enzimmel végzett bontása útján állítunk elő). A tenyészetek pH-értékét 25%-os vizes ammónium-nidroxid-oldattal 6,2 ± 0 1 értéken tartjuk. A tényezeteket 1440 órán át 29 *C-on fermentáljuk (fordulatszám: 320 perc"1, levegőztetés! arány: 1 tf-rész tenyészlére percenként 0,75 tf-rész 20 levegő, túlnyomás: 0,03 MPa). 580 Uter tenyészlét kapunk, amely miUiUterenként 6,85 mg nurzeotricint tartalmaz. 7. példa 4200 Uteres központi keverőve! ellátott, nemes acélból készült fermentorba az alábbi összetételű táp- 25 közeget töltjük 2500 Uter mennyiségben: 32 g burgonyakeményítő, 60 g glükóz, 11 g extrahált szójadara, 11 g ammónium-szulfát, 2 g magnézium-szulfát-heptahidrát, 1 g nátrium-klorid, 6 g kalcium-karbonát és 0,5 g cink-szulfát, csapvíz ad 1000 ml. Habzásgátlóként 1 liter tenyészlére számítva 0,5 g antaph- 30 ron NM-40-et adagolunk. Sterilizálás előtt a pH-értéket 6,2-re állítjuk. A glükóz nélküU tápközeget közvetlenül bevezetett vízgőzzel sterilizáljuk, és a sterilizálást a sterüizálási függvény aktuális (pillanatnyi) értékének bemeneti vezérlési jelkénti felhasználásával oc szabályozzuk. A függvény riévértéke St = 35 (a szenynyeződés valószínűsége 10"3, a sterilizálás előtti sejtsűrűség 5.166 sejt/ml tápközeg). Ezt a névértéket 120 °C plafon hőmérséklet mellett a bevezetett gőz mennyiségével szabályozzuk, a sterilizálási függvény aktuális értékét 40 St =Q/t [A,E,T(r)]dr összefüggés alapján a sterüizálási hőmérséklet időbeü alakulásában határozzuk meg (f/-/ * Arrhenius-függvény). A sterüizálási függvény névértéke és a lehűtött, sterilizált tápközegben lévő savoldható foszfátok koncentrációja közötti összefüggést az 1. ábra említett 45 névérték és a tápközeg pH-értéke közötti összefüggést a 2. ábra mutatja meg. Az St = 35 névérték 5 ml/1 kiindulási foszfát-koncentrádót és 8,0 pH-értéket jelent. A szükséges pH-értéket (7,4) kénsav-oldat adagolásával állítjuk be, miután az 50%-os oldat alakjá_n ban külön sterUizált (30 percen át 120 °C-on) glükózt csíramentes körülmények között a tápközeghez adtuk. A termelő tenyészet tápközegét - térfogatára számítva - az 5. példa szerinti második tenyészet 4%val beoltjuk, majd 29 '’C-on 120 órán át fermentáljuk. 0,03 Pa túlnyomás mellett a 0-12. órában percen- 5Q ként 1250 Uter levegőt, a 12-120. órában percenként 2500 Uter levegőt juttatunk a fermentorba, a keverőmű fordulatszáma 180 perc"1. ; A fermentációs folyamatokat a 3-7. ábrák szemléltetik, ahol a 3. ábra a nurzeotricin és a biomassza képződésébe ne1- időbeU alakulását mutntja (a bionnsssza száraz-1
