192388. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nurzeotricin előállításáraa, valamint só alakjában vagy adszorbeált állapotban történő kinyerésére
1 2 3. példa A 2. példában alkalmazott nurzeotricin-termelő törzs vázképző anyagként glükózt és zselatint tartalmazó micélium-szárítmányát (mintegy 300 mg) 3 ml 0,9%-os nétrium-klorid oldatban szuszpendáljuk. A szuszpenzió 0,5 ml-jével 400 ml előkultúrát oltunk be Az előtenyészet tápközegének összetétele és pH-értéke a 2. példáéval azonos. 400—400 ml mennyiségű tápközeget 2500 ml térfogatú üvegekbe töltünk, az üvegeket vattacsomóval lezárjuk és autoklávban 121 °C-on 35 percen át sterilizáljuk. A szobahőmérsékletre hűtött, beoltott tenyészeteket 180 perc'1 frekvenciájú rázóasztalon 29 C-on 48 órán át fermentáljuk. Az így kapott első előtenyészet 1200 ml-jével a második előtenyészetet, mégpedig 150 liter azonos összetételű tápközeget (amelyet 121 °C-on egy órán át sterilizáltunk) oltunk be. A második előtenyészetet 250 liter térfogatú, steril levegőztetésre alkalmas berendezéssel felszerelt, nemes acélból készült fermentorban fermentáljuk 27—29 °C-on 240 perc"1 fordulatszám mellett, 1 literre számítva percenként 1 liter levegővel levegőztetve a tenyészetet. A termelő tenyészeteket végül 710 liter térfogatú steril levegőztetésre alkalmas berendezéssel felszerelt, nemes acélból készült fermentorokban alakítjuk ki. Fermentoronként 500 liter BO-34 jelű tápközeget (recept: lásd 2. példa) alkalmazunk, és habzásgátlóként 0,5 g/1 antaphron-t adagolunk. Sterilizálás előtt a pH-értéket 6,7 és 7 közötti értékré állítjuk. Sterilizálás céljából a glükóz nélküÜ tápközeget a fermentor fűtőköpenyével 70 °C-ra, majd vízgőz közvetlen bevezetésével 121 °C-ra melegítjük és ezen a hőmérsékleten 15 percen át sterilizáljuk. A 30 °C-ra lehűtött tápközeghez steril körülmények között a glükózt adjuk, amelyet előzetesen 50%-os vizes oldat alakjában 121 °C-on végzett 30 perces hőntartással külön sterilizálunk. Beoltás előtt a pH-értéket steril vizes 10%-os kénsav-oldat adagolásával 6,9 és 7,1 közötti értékre álltjuk. A termelő tenyészeteket a második előtenyészetből vett 5% inokulummal beoltjuk, majd 28-30 °C- on, percenként 500 liter 0,14-0,16 MPa nyomású levegővel levegőztetve 320 perc"1 fordulatszámú keverővei keverve fermentáljuk. A két tenyészet egyikéhez a beoltást követő második órától kezdve 87 g KH2P04 vizes oldatát adagoljuk adagoló szivattyúvá egyenletes ütemben. Ha a pH érték 6,3 alá süllyed, 25%-os vizes ammónium-hidroxid -oldattá visszaállítjuk. Fermentáás közben csíramentes körülmények között mintákat veszünk mindkét tenyészetből. A mintákban a nurzeotricin-bázis koncentrációját, továbbá a glükóz, az ammónium-nitrogén és a szilárd anyagok mennyiségét mérjük. A távozó levegő pH-értékét és COj -tartalmát regisztráló műszerrel az egész folyamat áatt rögzítjük. Ha a glükóz koncentrációja 5 g/1, vagy az ammónium-nitrogén koncentrációja 0,2 g/1 áá süllyedt (ezt a pH érték emelkedése, illetve a távozó levegő COj-tartámának csökkenése alapján vesszük észre) 5000 g glükózt, illetve 1800 g ammónium-szulfátot adagolunk tömény, steril vizes oldatok áakjában. A másik tenyészethez sem foszfátot, sem glükózt vagy ammónium-szulfátot nem adunk, a pH-értéket nem szabályozzuk. A folyamatos pH-mérés 6,4 és 7,2 közötti értékeket mutat. A fermentáás megszakítás ikor a kontroll fermentáás tápközegében még 5 g/1 nél több glükóz és 0,5 g/1 ammónium-nitrogén van. A két tenyészlé szűrletének nurzeotrlcin-tartámát a fér nentáási Idő függvényében a 4. táblázat mutatja. 4 példa Nagyteljesítményű Sptreptomyces noursei törzs micéliumából készített szárítmányt fiziológiás konyhasóoldatban szuszpendáunk, és a szuszpenzióval beoltjuk az első előtenyészet tápközegét. A tápközeg 1 liter csapvízben az alábbi komponenseket tartalmazza: 15 g glükóz, 15 g extrahát szójadara, 0,3 g KH2P04, 5,0 g Na Cl, 1,0 g CaC03, sterilizáás előtti pH-érték: 6,5- 6,9. A tápközeget 50 milliliterenként 500 ml térfogatú üvegekbe töltjük és 120 °C-on 35 percen át sterilizájuk. Az első előtenyészetet forgó rázógépen 28 °C-on 48 órán át fermentájuk. A második előtenyészethez 2000 ml térfogatú rázólombikot és lombikonként 250 ml tápközeget használunk. Az első előtenyészetet inokulumként ákámazzuk, mégpedig 1 tf-rész inokulumot 25 tf-rész táplözegre. A második előtenyészetet forgó rázógépen 24 órán át fermentájuk. A második előtenyészet 600 ml-jével 800 liter oltótenyészetet oltunk be. Az oltótenyészet tápközegének összetétele az alábbi: 15 g glükóz, 15 g extrahát szójadara, 0,3 g KH2P04, 5,0 g NaCl, 1,0 g CaCOs, 5 g antraphon, 37,5 g napraforgóolaj, csapvízzel ad 1000 ml. Sterilizáás előtt a pH-értéket 7,2 és 7,4-re állítjuk, sterilizáás után 6,8 és 7,0 közé esik. A tápközeget 120 °C-on 60 percen át sterilizájuk. A fermentáást 28 °C-on végezzük., Mintegy 30 óra elteltével a tenyészíéből 60 mg/I oldható foszfát fogyott ugyanakkor 12-15 g/1 biomassza képződött. A 800 liter oltótenyészet elegendő a termelő tenyészet kb. 18 m3 térfogatú mennyiségének beoltására. A termelő tenyészet tápközegének összetétele az aláobí: 15,0 g/1 extrahát szójadara, 1,0 g NaCl 32,Og bu gonyakeményítő, 6,0 g CaCC>3, 0,5 g ZnS04. ,7H20, 2,0 g MgS04.7H20, 3,0 g napraforgóolaj, 0,3 antaphron, 29,0 glükóz, 6,0 g (NH4)2S04l csapvíz ad 1000 ml. A glükózt és az ammónium-szulfátot 120 °C-on külön 30 percen át sterilizáljuk, majd utána a tápközeghez adjuk. A tápközeget 115 °C-on 60 percen át sterilizájuk, elette a pH-értéket 7,5 és 7,8 közötti értékre állítjuk, sterilizáás után a pH 7,2 és 8,2 közötti érték, a külön sterilizált komponensek hozzáadása után 7,0 és 7,4 közötti pH-értékre áll be. A tenyészetet 28 °C-on fermrntájuk, 0,02 MPa nyomású levegő 60% perdáis Oj-nyomás mellett, percenként 1 térfogatrész tény észlére számítva 0,3 térfogatrészével levegőztetve. Ha glükóz koncentrációja 15 g/1, illetve az ammóni ím-nitrogén koncentrációja 0,2 g/1 áatti értékre süllyed, ezeket a komponenseket 50%-os steril oldat áakjában adagoljuk 5,2 értékű pH és 200 mgA ammóni rm-nitrogén koncentráció eléréséig. A további ammónium-nitrogént .ammóniái í víz pH * 5,5 mellett végzett adagolásává juttatjuk a tenyészetbe. 130 óra fermentáás után a tenyészlé nurzeotrictn-koncentrációja 8000-11 000 Júg/ml. 5. példa Literenként 4- g glükózt, 15 g extrahát szójadarát, 0,3 g KH2P04-t 5 g NaCl-t, 3 g CaCOj és ad 1000 ml csapvizet tartámazó sterilizált tápközeget. 192.388 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 6
