192388. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nurzeotricin előállításáraa, valamint só alakjában vagy adszorbeált állapotban történő kinyerésére
1 2 •nehezen oldódó port képez, összetétele (C 40,31 40,44, H 6,42, 6,21, N 16,21, 16,49) és oxálsavtartalma (20,12, 20,28) a streptotricin-D-oxalát (^'31^58*^12^10'^’^ lUO) és streptotricín-F-oxalát (CjoHj^Ngög 1,5 H2O) 1:1 arányú keverékének az összetételét közelíti meg. A nurzeotricin foszfátja amorf, fehér, vízben jól oldódó, alkoholokban és egyéb szerves oldószerekben nehezen oldódó port képez. Elérni összetétele (C = - 31,59, 31, 85, H = 6,25, 6,63, N = 14,95, 15,18, P ■ 10,08, 10,36) a ,streptotricin-D-foszfát (CarH^oN, 7O1A. 4 H0PO4 0-1 H-,0) és streoptotridn.F.foszfaT(CfoH34N8Og . 2 H3P04. 0-1 H20) 1:1 arányú keverékének összetételével azonos. A kapott sók relatív mikroba elleni hatását mikrobiológiai módszerrel, lyukas_ lemezen végzett diffúziós teszttel határozzuk meg’ kísérleti mikroorganizmusként a Bacillus subtilis ATCC 6633 törzset alkalmazzuk. Referenciaként tisztított nurzeotricin-szulfátot használunk, összetétele a streototricin-D-szulfát és streptotricin -D-szulfát és streptotricin-F-szulfát 1:1 arányú keverékének felel meg, hatóanyagtartalma: 702 jug bázis/mg. A mikrobiológiai kísérlet körülményeit úgy választjuk meg, hogy a 10 pg bázis/ml koncentrációjú oldat 0,5 ml-je 9 mm lyukátmérő mellett 19 ± 1 mm méretű gátiási zónát eredményezzen. Kiviteli példák 1. példa A Strcptomyces noursej ZIMET 43716 jelű törzs agyagföld hordozón liofilizált spórakészítményét Emerson agarra szórjuk. A lemezeket mintegy 7 napig 30 °C-on inkubáljuk. Után a núcéliumból mintegy 2 cm2 felületű darabokat kivágunk, és 1—1 darabbal beoltjuk az első előtenyészet 1-1 tenyészetét. Az első előtenyészet tápközegének összetétele az alábbi: literenként 40,0 g glükóz, Í5,0 g extrahált szójadara, 0,3 g KH2P04, 5,0 g NaQ, 3,0 g CaC03, csapvízzel ad 1000 ml, sterilizálás előtti pH: 6,5—6,9. 50-50 ml mennyiségű tápközeget 500 ml térfogatú, vattacsomóval elzárható üvegedényekbe töltünk és autoklávban 35 percen át 121 C-on tartva sterilizáljuk. A beoltott tenyészeteket rázóasztalon 29 °C- on 48 órán át inkubáljuk. Az így kapott előtenyészet 3-3 ml-jével a főkultúra (termelő tenyészet) egy-egy edényét oltjuk be. A termelő tenyészet ,tápközeg literenként az alábbi két alaptápot tartalmazza: BO-30 jelű közeg: 29,0 g glükóz, 13,0 g extrahált szójadara, 5,0 g NaCl, 3,0 g CaC03, csap víz ad 1000 ml, sterilizálás előtti pH-érték: 6,5 BO-31 jelű közeg: 30,0 g kukoricakeményítő, 3,0 g glükóz, 7,0 g extrahált szójadara, 5,0 g NH4N03, 2,0 g MgS04, 5,0 g NaCl, 3,0 g CaC03, csapvíz ad 1000 ml, sterilizálás előtti pH-érték: 6,0. 80-80 ml mennyiségű tápközeget 500 mi térfogatú üvegedényekbe töltünk. Az edényeket vattacsomóval elzárjuk és autoklávban 121 °C-on 30 percen át sterilizáljuk. A beoltással egyidejűleg az 1. és 2. táblázatban megadott adalékok sterilre szűrt, vizes, semleges oldatát adjuk a tenyészethez (legfeljebb 3 ml/80 ml tápközeg). A tenyészeteket 180 perc'1 frekvenciájú rázóasztalon 26 c-on 72—120 órán át inkubáljuk. Az inkubálás alatt az említett lyuklemezes teszttel - kísérleti mikroorganizmusként Bacillus subtilis ATCC 66330t alkalmazva - a maximális nurzeotricin-koncentrációt meghatározzuk. Az 1. és 2. táblázatban féltül tétjük az adalékok koncentrációja és a maximális nurzeotricin-koncentráció közötti összefüggést. A tenyészlét a 8-13. példák szerint dolgozzuk fel. 2. példa A Streptomyces noursei ZIMET 43716 jelű törzs NG 13-14 jelű variánsának agyagföld hordozón llofiljzált spórakészítményét Emerson féle táptalajra szórjuk, majd 30 °C-on mintegy 7 napog inkubáljuk. Utána a micéliumból mintegy 2 cm2 méretű darabokat kivágunk és minden darabbal beoltjuk az előkultúra egy edényét. Az előkultúra tápközege 1 liter csrpvízben az alábbi anyagokat tartalmazza: 40 g glükóz, 15 g extrahált szójadara, 0,3 g KH2P04, 5 g N iCl és 3 g CaC03. Sterilizálás előtt a pH-értéket 6 5-re állítjuk. 50 -50 ml mennyiségű tápközeget 500 ml térfogatú üvegekbe töltjük, az üveget vattacsomóvíd elzárjuk és autoklávban 121 °C-on 35 percen át sterilizáljuk. A beoltott előtenyészeteket rázóasztalon 29 °C-on 48 órán át inkubáljuk. A kapott előtenyészet 150 mijével beoltjuk a iaborfermentorben lévő 2500 ml térfogatú főteny észetet. A termelő tenyészet esetén Bo-34 jelű tápközeget alkalmazunk, amely csapvízben literenként az alábbi lomponenseket tartalmazza: 32 g burgonykeményítő, 29 g glükóz, 11 g extrahált szójadara, 11 g (NH4)2- S04, 2 g MgS04.7H20, 1 g NaCl, 6 g CaC03 és 0,5 g ZnS04,7HjO. 2500 ml tápközeghez szilikonbázisú habzásgátlóként 1 ml antraphron-t adunk. Sterilizálás előtt a pH-érték 6,0. A fermentor tény észedényét autoklávban 121 °C-on sterilizáljuk, majd 30 °C-ra lehűtjük és a tápközeg pH értékét csíramentes kötülméíyek között adagolt 10%-os steril kénsav-oldattal 6,8- a állítjuk. A beoltott tenyészetet 30 °C-on keverés közben (fordulatszám 800 perc'1) 168 órán át fermentáljuk, percenként 2500 ml levegővel levegőztetve. A beoltás után másfél órával megkezdj ük a kálium-hidrogén-foszfát adagolását, mégpedig 4 g KH2P04 l liter desztillált vízzel készített oldatából adagoló szivattyúval óránként 1,8 ml-t adagolunk. Ezt 5 órán át folytatjuk, majd a következő 21 órán át óránként 3,5 ml oldatot adagolunk. Fermentálás alatt steril körülmények között mintákat veszünk, és a mintákban a nurzeotricin-tartalmaz, továbbá a glükóz, az ammórúum-nitrogén és a szilárdanyag mennyiségét mérjük. A távozó levegő parciális oxigénnyomását, pH-értékét és széndioxidtartalmát regisztráló műszerrel az egész folyamat alatt rögzítjük. A tenyészet pH-értékét 5%-os steril nátrium-hidroxí-oldat adagolásával 5,8 feletti értéken tartjuk. Ha a glükóz koncentrációja 5 g/1 értékre, vagy az ammónium-nitrogén koncentrációja 0,2 g/1 értékre csökken (ezt a pH-érték és a parciális oxigénnyomás növekedése, valamint a távozó levegő C02 tartalmának csökkenése alapján vesszük észre), egyszeri adagban 25 g glükózt, illetve 10 g (NH4)3 S04-t adagolunk tömény, steril oldat alakja'ban. Azonos körülmények között kontrollfermentálást is végeztünk azzal az eltéréssel, hogy a kálium-dihidrogén-foszfát, glükóz és ammónium-szulfát adagolását mellőztük. Amikor a fermentálást félbeszakítottuk, a tápközeg még világosan kimutatható mennyiségű szabad glükózt és szabad ammóniát tartalmazott. Az adalékokkal fermentált, valamint a kontroll tenyészet nurzeotricin-tartalmát (bázisként számítva) a 3. táblázatban adjuk meg. 192.388 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5
