192388. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nurzeotricin előállításáraa, valamint só alakjában vagy adszorbeált állapotban történő kinyerésére
1 2 A találmány nurzeotricin előállítására, valamint só alakjában vagy adszorbeált állapotban történő kinyerésére vonatkozik. Neurzeotricln a streptomjcinek csoportjába tartozó antibiotikum. Ergotróp dózisban a haszonállatok , takarmányába keverve gyorsítja az élősúlygyarapodást, ugyanakkor a takarmány hasznosítását is javítja. Az antibiotikumot az állattartásban használják, a gyógyszeripar is kiszereli. Az ismert műszaki megoldások jellemzése A Streptomyces noursei ATCC 11455 egyik variánsának tenyézetéből izolált nurzeotricin in vitro hatékonyságot mutat Gram-pozitív és Gram-negatív baktériumok, valamint mikobaktériumok ellen (Brandler, G. és Thrum, H.: Nourseothrocin A und B, Zwei neue antibakteroelle Antiobiotika einer Streptomyces-noursei-Variante. Zschr. Allgem. Mikrobiol. 3, 105-112 /1963/). A nurzoetricin vízben és rövid szénláncú alkoholokban oldódó bázis, kézelhetőség szempontjából előnyösebbek a sói. A nurzeotricin molekulája (lásd 8. ábra) a gulozamin aminocukorból, valamint a streptolinból és y-lizin aminosavak - ból épül fel. A nurzeotricin egyes komponensei a molekulában lévő, egymáshoz peptidkötéssel kapcsolódó 0-lizin-csoportk számában és az R, R és R” jelentésében különböznek egymástól. A nurzeotricin-komplex közel 90%-át a mintegy azonos arányban jelenlénvő F és D főkomponens teszi ki, míg 10% a C és E mellékkomponensek arány (Grafe, U., Becker, H. Reinhard, G., és Thrum, H: Regulative Beeinflussung der Nourseothircinbiosynthese durch o-Aminobenzoesaure in Kulturen des Streptomyces noursei JA 3890b. Zschr. Alig. Mikrobiol. 14, 659-673 /1974/). A nurzeotricin antibiotikumot termelő Streptomyces noursei törzs ZIMET JA 3890b szám alatt az NDK Tudományos Akadémia Mikrobiológiai és Kisérletiterápiai Központi Intézetének törzsgyűjteményében letétben van, mostani jelölése ZIMET43716. Az irodalomból ismert eljárások során (Bocket, H. és H. Thrum: Stimulation of nourseithricin production by aminobenzoie acids, Herold, M., és Z. Gabriel: Antibiotics - Advances in research, production and clinical use. London 1966, p. 584.587) a tenyésztés aerob körülmények között történik. Az említett Streptomyces-törzs liofilizált spóráit alkalmas agartáptalajra viszik, a tenyészetet 28-30 °C-on 6-10 napig inkubálják, majd a megnövekedett, spórás micéliumot folyékony steril tápközeg beoltására használják fel. Oltáshoz lehet a nurzeotricint termelő törzs süllyesztett kultúrában nőtt, majd zselatinon szárított micéliumának konzervált formáját is használni, Az oltóanyag süllyesztett kultúrájú tenyésztéséhez szükséges folyékony tápközeg szubsztrátumként szén- és nitrogénforrásokat, valamint szervetlen sókat tartalmaz. Szénforrásként glükózt és/vagy glicerint alkalmaznak, nítrogénforrásként főleg szója- Uszt, különböző aminosavak és/vagy ammóniumsók használatosak. Az oltóanyag számára legkedvezőbb kiindulási pH-érték 6,0 és 6,7 közötti érték. A tenyészetet 28-30 °C-on 24—48 órán keresztül fermentálják. Az így kapott oltóanyag steril folyékony tápközeg beoltásához szolgál, ez lesz a főkultúra. A tápközeg szén- és nitrogénforrás kukoricakeményítőt és/vagy glükózt tartalmaz, míg nitrogénforrásként főleg szójalisztet, különböző aminosavakat és/vagy ammóhiumsókat alkalmaznak. Az antibiotikum termelése ízempontjából a legelőnyösebb kiindulási pH-érték !>,0 és 7,5 között van. A fermentálás 26-32 °C«n, előnyösen 28-30 °C-on történik és 150 óráig tart, A Streptomyces noursei ZIMET JA 3890b törzs iüilyesztett kultúrájú tenyésztése ismert módon, rázott tenyészet formájában, vagy keverővei és levegőztetővei felszerelt fermentorokban történik pótlólagos szubsztrátum adagolása, illetve pH-szabáiyozás nélkül. Ismert (Bradler, G. és H. Thrum: Noursethricin A und B, zwei neue antibakterielle Antibiotika einer Streptomyces-noursei-Variante, Zsch. Allgem. Mikrobiol. 3, 105-112/1963/), hogy a nurzeotricin viszonylag csekély hozama aminoarilkarbonsavak, különösen 5—10 mmól o-aminobenzocsav hozzáadásával növelhető. A főkultúra beindításakor adagolt vegyidet az Ismert körülmények között 5-10-szeres hozamot biztosít (lásd Bocker és Thrum fent említett munkáját). Ismert, hogy o-aminobenzoesav és/vagy egyéb ami-’ noarilkarbonsavak az a-típusú citokrómok (dtokróm-oxidázok) képződését szelektíve elnyomják, így közvetve gátolva az aminosavak sejtbe szállítását, valamint az aminosavaknak a sejtekben történő oxidativ dezaminálódását. Ez részint a másodlagos anyagcsere nitrogén-katabolitok sejten belüli tűltengése okozta represszióját megszünteti, másrészt megakadályozza, hogy a nurzeotricin prekurzorként szükséges aminosavak már a termelő mikroorganizmus növekedési szakaszában használódjanak fel. A nurzeotricin képződésének szakaszában ezek az aminosavak a másodlagos anyagcsere rendelkezésére állnak, mert a biomassza növekedése során a mikroorganizmus a szervetlen nitrogénforrást (az ammonium nitrogénjét) részesíti előnyben. Bár az aminoarilkarbonsavak adagolása a hozam tetemes növelését eredményezi, a nurzeotricin előállítása fermentáció útján a költségek, valamint szennyvíztisztítási problémák miatt nagyipari termelésre nem alkalmas. Ismert továbbá, hogy a legtöbb másodlagos metabolit bioszintézését feleslegben jelenlévő foszfát nagymértékben gátolja (összefoglalót lásd: Martin, J.F. és Demain A.L.: Controll of antibiotic biosynthesis, Microbiol. Hév. 44, 230-251 J1980/). Ez az oka annak, hogy technikai mértékben a másodlagos anyagcseretermékek, például antibiotikumok előállítását szolgáló fermentációs eljárásokat olyan foszfát-koncentráció mellett valósítanak meg, amely a termelő törzs számára nem is optimális. A másodlagos anyagcseretermékek fermentálás útján történő előállítása során állati és növényei eredetű komponensekből (keményítő, szójaliszt. kukoricalekvár, melasz, húspcpton stb.) kialakított komplex táptalaj kerül alkalmazásra. A komponensek - eredetüktől és előkezelésüktől függően - különböző mennyiségű foszfátot tartalmaznak, és a foszfáz hozzáférhetősége (feszívódása) is különböző. Ez a körülmény a tápközeg tipizálását alapvetően nehezíti. Az oldható és felvehető foszfát kiindulási koncentrációja azonban rendkívül fontos a kívánt másodlagos metabolit hozama szempontjából, ónért egyrészt a termelő mikroorganizmus növekedéséhez bizonyos mennyiségű foszfát szükséges, másrészt viszont a kiindulási foszfátkoncentráció túl magas értéke a másodlagos anyagcseretermék képződését inhibáija. 192.388 5 10 15 20 25 30 35 40 45 60 55 60 2
