192388. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nurzeotricin előállításáraa, valamint só alakjában vagy adszorbeált állapotban történő kinyerésére
1 2 A 155 239 sz. NDK-beli szabadalmi leírás szerint a tenyészlében jelenlévő foszfátionok koncentrációját szabályozóként használják fel a fermentálási program stabilizálására. Az említett eljárás azonban csak biomassza előállítására vonatkozik, a koncentráció beállított névértéke 20-60 mg/1 foszfor. Az eljárást mindezideig szakaszos mikrobiológiai kultúrákban a másodlagos anyagcseretermékek bioszíntézisének szabályozására nem használták fel. A másodlagos anyagcseretermékek előállítását szolgáló mikrobiológiai eljárások hatékonyságának javítása során a mikroorganizmust és a tápközeget kölcsönös módosításokkal úgy hangolják össze, hogy a foszfát két ellentétes szabályozó befolyása között kompromisszum keletkezik. A teljesítmény lépcsőzetesen végzett növelésének ezen útja azonban hosszadalmas és költséges. Ismert továbbá, hogy a tápközeg összetételének megváltoztatása mellett más út is létezik a fermentációs hozam növelésére: a fermentáció összes paraméterének megmérése és ennek alapján a folyamat szabályozása (Sukatsch, D.A. és G. Nasemann: Automatische Parameterefassung bei industriellen Fermentationen, Chemie-Technik 6,261 /1977/). Az említett szabályozó módszer esetén az elsődleges szabályozó paraméter azonban nem a szubsztrá-' tűm koncentrációja (ezt többnyire csak utólag, hoszszabb elemzés után tudják megállapítani), hanem a folyamatosan mérhető globális paraméterek, így pH-érték, pO?-érték, adagolás mennyiségek, a távozó gáz összetétele, hőképződés). A nurzeotricin elkülönítésével kapcsolatban végül ismert, hogy a mícéliumtól mentesített szürletből a hatóanyagot alkalmas kationcserélőkkel adszorbeáltatják, híg savval eluálják, majd az eluátumok semlegesítése és betöményítése után a nyers terméket többszörösen metanol és aceton elegyéből átkristályosítják, majd szárítják (lásd Bradler és Thrum fent említett cikkét). A találmány célja A találmány célja olyan eljárás, amellyel a nurzeotricin hatóanyagot időre és térfogatra vonatkoztatva nagy hozammal állíthatjuk elő. A találmány lényegének ismertetése Az találtuk, hogy a nurzeotricin bioszintézisét stimulálhatjuk, ha a főtenyészethez indításkor a légzés folyamatait gátló anyagokat, például nátrium-azodot vagy egyéb alkálifém-azidot, pirokatechnint, valamint a mit ált (etil-izoamil-barbitursavat) és/vagy az élő sejtben az aminosavak transzportját gátló anyagot, például béta-alanint vagy vízben oldódó cinksókat adunk. Amennyiben nagy keményítőbontó aktivitású törzset és polimert szénforrást, különösen kukoricakeményítőt alkalmazunk, a légzés folyamatait gátló és/vagy az aminosavak sejten belüli transzportját gátló adalék nem szükséges. A nurzeotricin termelő tenyészetek anyagcsere aktivitását (felszívódás, savképződés, glükóz- és ammóniumfelvétel, antibiotikum termelés) elsődlegesen nem a szén- és nitrogénforrás kínálatától, hanem a foszfát hozzáférhetőségétől függ. Fontos, hogy az oldható és biológiailag felhasználható foszfát kiindulási koncentrációját a táptalaj sterilizálása során, a foszfát- és a szulfátionokkal nehezen oldódó csapadékot eredményező szervetlen sók, illetve fémionok koncentrációja alapján csökkenthetjük. Azt tapasztaltuk, hogy elegendő szulfátion jelenléte esetén a kezdeti koncentrációk csökkenésének a pH-érték eltolódása az oka, a kalcium-szulfát kicsapódik és eltávolítja a savas szulfátionokat, a pH-érték bázikus tartomány felé eltolódik. Az oldható, illetve felszívódásra képes foszfát koncentrációját tehát úgy is sökkenthetjük, hogy a sterilizálás elején alkáíikus pH-értéket állítunk be. A pH-érték növelése biztosítja azokat a körülményeket, amelyek között a tápközegben lévő fémionok a foszfáttal, oldhatatlan csapadékot képeznek. A foszfáttartalmú csapadék kiválását fémionok, így icink(II)-. és/vagy vas(lll)-, alumíniumon)-, magnézium(II)-, kalcium(II)-, mangán(ll)ionok fokozzák. A foszfátok kicsapása szempontjából különösen előnyös a legtöbb ipari fermentálás során alkalmazott túlhevített vízgőzös sterilizálás, kalcium-karbonát jelenlétében. A kalcium-karbonátot pH-pufferolás céljából adagolják. A tápközeg foszfortartalmát elvileg a foszfáttartalmű tápanyagok mennyiségének csökkentésével Is csökkenthetjük. Ezzel az eljárás költsége is csökken. A fenti körülmények között az oldott, illetve biológiailag hozzáférhető foszfát kezdeti koncentrációja csökken, azaz a termelő törzsre jellemző felső foszfát-koncentrációjánál mindenképpen kisebb. (A másodlagos metaboüt-szintézis foszfát-érzékenysége miatt egy bizonyos foszfátkon centráció felett nurzeotricin már nem termelődik.) Ezek a kis foszfát-koncentrációk lehetővé teszik, hogy sterilizálás után definiált foszfátadagolással foszfát szempontjából meszszcmenően tipizált tápközeget nyerjünk. Emellett a foszfát adagolásának ütemével a mikroorganizmusok foszfát-anyagcseréjét a kívánt nagy hozam irányában szabályozhatjuk. A foszfáttot oldat, szuszpenzió vagy szilád halmazállapotú anyag alakjában adagolhatjuk szabad foszfátion vagy kémiailag, illetve fizikailag kötött foszfát formájában. A fermentálás technológiájától függően a foszfáttartalmú anyagokat vagy a foszfátot sterilizálás után vagy fermentálás alatt adjuk a tápközeghez egyszeri vagy többszöri vagy folyamatos adagolással. A folyamatos adagolás során az időegységre vetített mennyiség változó lehet. Az említett foszfát hozzáadódik, a komplex foszfátforrásokból, így szójalisztből, földimogyorólisztből, burgonyakeményítőből hidrolízise illetve enzimatikus bontás útján, vagy szervetlen üledék-anyagokból reverzibilis módon felszabaduló foszfáthoz. Az említett szerves anyagok hidrolízis, bázikus kémhatás mellett végzett sterilizálással fokozható. A hidrogénionok koncentrációjának (fiziológiai határokon belül történő) emelése következtében a szervetlen anyagokból jobban szabadul fel a foszfát, és ennek köszönhetően a metabolikus aktivitás növekszik. Peremfeltételként biztosítani kell, hogy a nurzeotricin képződése szempontjából káros szubsztrát-limitálás (eszenciális tápanyag hiánya) ne következzék, be. A sterilizálást tehát bázikus tartományban, 7,4 és 7,8 közötti pH-érték mellett végezzük, a végleges pH- tartomány: 7,2-8,8. Azt találtuk továbbá, hogy a nurzeotricin képződését hosszabb időn keresztül kedvezően befolyásolhatjuk, ha a fermentációs folyamat során 5,0 és 6,5 közötti pH mellett a glükóz és a szervetlen nitrogén arányt 5—15 fi,015 -0,2 (g/1 glükóz g/1 szervetlen nitrogén) értékre állítjuk be, és a fér* 192.388 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
