192254. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán leukocita és humán gamma interferon egymást követően történő előállítására
1 192 254 2 előnyösen 37 °C. Ezután a sejteket a folyékony fázistól elválasztjuk. A felülúszó (szupernatans) réteg tartalmazza a nyers alfa interferont, melyet -20 és +4 “C között tárolhatunk, vagy ismert módszerekkel tisztíthatunk. 5 A sejteket ezután mossuk, egy alkalommal valamilyen fiziológiás sóoldattal, előnyösen a fent leírt összetételű tápoldattal. A mosás után a sejtkoncentrációt 5 x 10®-108, előnyösen 2,5 x 107 értékre állítjuk be, tápfolyadékban vagy tápoldatban, elő- 10 nyösen az előzőek során ismertetett összetételű tápoldatban. A tápoldat valamilyen emberi vagy állati szérumot, illetve globulin-mentes szérumot, előnyösen human globulin-mentes szérumot tartalmaz 0,5-5 mg/ml, előnyösen 1-2 mg/ml koncentráció- 15 ban (3-6%). A sejteket ezután valamilyen gamma interferon inducerrel hozzuk össze. E célra előnyösen Concanavalin A, Phytohemagglutinin vagy Staphylococcus enterotoxin alkalmazható. Eljárásunk előnyös 20 foganatositási módja szerint inducerként Concanavalin A-t alkalmazunk, előnyösen 2,5-30 pg/ml, különösen előnyösen 15 pg/ml koncentrációban. Az indukció időtartama 8-48 óra, előnyösen 12-16 óra, az alkalmazott hőmérséklet 35-39 ’C, 25 előnyösen 37 °C. Az inducert bizonyos idő (kb. 1 óra) elteltével kívánt esetben mosással eltávolíthatjuk, ez a művelet azonban el is hagyható, mivel az inducer jelenléte a gamma interferon termelését nem zavarja. Az inducert általában nem távolítjuk 30 el. Ezután a sejteket a folyékony fázistól elválasztjuk. A felűlúszó tartalmazza a nyers gamma interferont, amely azonban alfa interferonnal fertőzött, mivel a második, vagyis a gamma interferon termelés periódusában az alfa interferont termelő sejtek 35 még többé-kevésbé képeznek interferont. Az interferonok egymás antivirális hatását potencírozzák, igy csak kalibrációs görbe segítségével számolható ki a gamma-alfa interferon keverékek valóságos gamma interferon tartalma (lásd 1. áb- 40 ra). A gamma interferon mennyiségének kiszámításához ismerni kell a keverék potencírozott szintű titerét, valamint a keverék alfa interferon tartalmát. Ezen utóbbit a keverék pH2 kezelését követő titrálásával határozhatjuk meg, mivel a gamma in- 45 terferon szelektíven elbontható ezzel a behatással. A pH2 kezelés során az interferon mintát KC1 oldattal szemben dializáljuk, melynek pH értéke 2 (időtartam: 24 óra), eközben a gamma interferon elbomlik, az alfa interferon stabil marad. 50 A tiszta gamma interferont a nyers gamma interferon alfa interferon mentesítése után nyerjük. A nyers gamma interferon részleges tisztítása és koncentrálása (pl. CPG-350 porózus üvegszemcséken, Electro-Nucleonics, N. J. USA) után végezzük 55 el előnyösen az alfa interferon mentesítést. Egyik lehetséges módszer a két interferon eltérő molekulasúlyán (alfa; 18-21 000, gamma: 40-45 000 dalion) alapuló gélszűrési eljárás (pl. Sephacryl S-200 kromatográfia), míg a másik módszernél Sepharose go gélhez kötött anti-alfa interferon ellenanyagokkal kötjük meg a gamma interferont szennyező alfa interferont. A találmányunk tárgyát képező eljárás előnye, hogy az alfa és gamma interferont egyazon leukoci- 65 ta kultúrában állíthatjuk elő két lépésben. Az egy interferonra eső előállítási költség jelentősen csökken, mivel az interferon előállításával kapcsolatos kiadások nagyobbik hányada esik a vérminták begyűjtésére, a „buffy coat”-ok elkészítésére és a fehérvérsejtek tisztítására. Eljárásunkkal a korlátozott mennyiségben rendelkezésre álló fehérvérsejtek interferon termelését lényegesen növeljük. Eljárásunk további részleteit az alábbi példákban ismertetjük, anélkül, hogy találmányunkat a példákra korlátoznánk. 1. példa ACD oldatba (nátrium citrát : 13,2 g/1, citromsav: 4,8 g/1, glulóz: 25 g/1) vett vért 3 órán át +4 ’C-on tároljuk. Egy térfogatrész ily módon kapott fehérvérsejt koncentrátumot 5 térfogatrész 0,83%os jéghideg vizes ammónium-klorid oldattal elegyítjük. A szuszpenziót a vörösvértestek lizálásáig (5—10 perc) jég között tartjuk, majd a leukocitákat az alábbi összetételű tápfolyadékban szuszpendáljuk: Komponens kalcium-klorid kálium-klorid magnézium-szulfát vagy ekvivalens magnézi um-klorid nátrium-klorid nátrium-hidrogén-karbonát nátrium-dihidrogén-foszfát glükóz ferri-nitrát Mennyiség 175-350. rng/1 300-500 mg/1 175-500 mg/1 5000-7000 mg/1 200-3500 mg/1 30-150 mg/1 500-5500 mg/1 0-0,2 mg/1 Ezután a vörösvértestek lizálását a fenti módszerrel megismételjük, azzal a változtatással, hogy 1 térfogatrész fehérvérsejt szuszpenzióra 10 térfogatrész 0,83 %-os vizes ammónium-klorid oldatot alkalmazunk. A leukocitákat az előzőekben ismertetett összetételű tápoldatban szuszpendáljuk és a sejtszámot 1 x 107 sejt/ml értékre állítjuk be. A tápoldat 2 mg/ml human globulin-mentes szérumot tartalmaz (kb. 6%). A sejteket 37 *C-on állandó keverés mellett 200 NE/ml mennyiségű inducer mentes koncentrált human alfa interferonnal kezeljük. Két óra múlva a sejteket 400 hemagglutináló egységnyi Sendai vírussal indukáljuk. Az inkubálást az indukciót követő 18. órában fejezzük be. A felülúszó, azaz a nyers alfa interferon antivirális titere 54 200 NE/ml. Az alfa interferon termelésére használt sejteket egyszer a fent említett tápoldattal mossuk, majd a leukocitákat a tápoldatban 2,5 x 101 sejt/ml koncentrációban szuszpendáljuk. A tápoldat 1 mg/ml mennyiségű globulin-mentesített human szérumot (kb. 3%) tartalmaz. Ezután a sejteket 15 pg/ml mennyiségű Concanavalin A-val stimuláljuk. Az inducert nem távolítjuk el a rendszerből. Az inkubációt állandó keverés mellett 37 ’C-on folytatjuk és az indukciót követő 16. órában a felülúszót centrifugálással elválasztjuk a sejtektől. A gamma interferont tartalmazó szupernatans antivirális titerének meghatározása WISH human amniális sejten történik, és a titereket human alfa 3
