192254. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán leukocita és humán gamma interferon egymást követően történő előállítására
1 192 254 2 interferon standarddal történő összehasonlítást követően egység/ml E/ml-ben fejezzük ki (jelenleg még nincs human gamma nemzetközi standard interferon preparátum). A felülúszó titere 10 600 E/ ml, mely azonban potencírozott szintű, mivel az előállított gamma interferon preparátumok alfa interferont is tartalmaznak. A mellékelt ábrán látható kalibrációs görbe segítségével az eredeti és a pH2 kezelt anyag titerének ismeretében a valóságos gamma interferon tartalom 1840 E/ml. összehasonlítás céljából a fenti eljárást azzal a változtatással végezzük el, hogy a gamma interferon termelés előtt a sejteket Sendai vírus nélkül inkubáljuk egy napig, így a Concanavalin A hatására termelődött gamma interferon titere: 340 E/ml. Szintén az összehasonlítás céljából az izolált leukocitákat az első, vagyis alfa interferon termelési periódust kihagyva rögtön Concanavalin A-val indukáljuk. A termelt gamma interferon titere: 450 E/ml. Ha a leukocitákat az alfa interferon termelési periódust kihagyva 1500 NE/ml human alfa vagy béta interferonnal az indukciót megelőzően 4 óráig kezeljük (priming), a termelt gamma interferon titere: 2300 E/ml. Tehát az alfa interferon kinyerése a fehérvérsejteknek az interferon tartalmú oldatból történő ki. centrifugálásából áll, így a felülúszó, mely az alfa interferont tartalmazza további feldolgozásra alkalmas, az üledék pedig, mely a fehérvérsejteket tartalmazza, friss tápfolyadékban szuszpendálva alkalmassá válik gamma interferon előállítására. A gamma interferon kinyerése hasonló módon történik. Az alfa interferontól történő mentesítés a gamma interferont tartalmazó anyag oszlopkromatográfiás módszerrel (pl. Sephacryl 5-200, Pharmacia) történhet, mely az interferonok közötti molekulasúly-különbség alapján választja szét a komponenseket. A gamma interferon mintákból az alfa-interferon eltávolítása anti-alfa interferon oszlopon történik, mely után a gamma interferon titere 1600 E/ ml. Az interferon meghatározásának elve, hogy a sejtekhez adott interferon megakadályozza a. fertőzésre használt vírus szaporodását. A meghatározást biológiai tesztben az interferon hígításaival végezzük, így ismert standard segítségével meghatározható az ismeretlen anyag antivirális titere. 2. példa Az 1. példában ismertetett eljárást azzal a változtatással végezzük el, hogy tápoldatként Eagle-féle tápfolyadékot alkalmazunk (Virology 14, 359, 1961). Az ilyen módon kapott alfa interferon titere 56 000 NE/ml. A termelés második szakaszában a szintén ebben a tápfolyadékban előállitott gamma interferon titere 1680 E/ml. Amennyiben a jelen eljárásnál az alfa interferon termelését elhagyjuk, a termelt gamma interferon titere: 280 E/ml. Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás alfa- és gamma-interferon előállítására a vér fehérvérsejt-frakciójának (bufiy coat) elválasztása, a vörösvértestek eltávolítása, a leukociták megfelelő tápoldatban történő szuszpendálása, majd alfa-interferon induktorral és gamma-interferon induktorral történő kezelése útján, azzal jellemezve, hogy az alfa-interferont és gamma-interferont ugyanazon fehérvérsejt kultúrában egymás után termeljük oly módon, hogy a vér fehérvérsejtfrakciójának elválasztása, a vörösvértestek eltávolítása és a leukociták megfelelő tápoldatban történő szuszpendálása után kapott szuszpenziót alfavagy beta-interferonnal előkezeljük, valamely alfainterferon inducerrel érintkezésbe hozzuk, az alfainterferon-tartalmú folyadékot a sejtektől elválasztjuk, az alfa-interferont kívánt esetben kinyerjük, a sejteket mossuk, megfelelő tápoldatban szuszpendáljuk, valamely mitogén ágenssel kezeljük, a gamma-interferon-tartalmú folyadékot a sejtektől elválasztjuk és a gamma-interferont kívánt esetben kinyerjük és kivánt esetben alfa-interferontól mentesítjük. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az előkezelést 10-500 NE/ml - előnyösen 200-300 NE/ml - alfa- vagy beta-interferonnal végezzük el. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az előkezelést 1-6 órán át - előnyösen 2 órán keresztül - végezzük el. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az előkezelést 35-39 °C- on - előnyösen 37 °C-on - végezzük el. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy alfa-interferon inducerként nyers vagy tisztított Sendai-vírust alkalmazunk. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a Sendai-vírust 100-800 - előnyösen 400 - hemagglutináló egység/ml koncentrációban alkalmazzuk. 7. Az 5. vagy 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alfa-interferon indukciót 5-48 órán át - előnyösen 15-20 órán keresztül - végezzük el. 8. Az 5-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alfa-interferon indukciót 35—39 °C-on - előnyösen 37 °C-on - végezzük el. 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gamma-interferon indukciót 8-48 órán át - előnyösen 12-26 órán keresztül - végezzük el. 10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kapott nyers gammainterferont részlegesen tisztítjuk és koncentráljuk, majd a benne levő alfa-interferont gélszűréssel vagy anti-alfa-interferon ellenanyagokkal történő megkötéssel eltávolítjuk. 11. Az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy tápoldatként 175-350 mg/1 kalcium-kloridot, 300-500 mg/1 kálium-kloridot, 175-500 mg/1 magnézium-szulfátot vagy azzal ekvivalens magnézium-kloridot, 5000-7000 mg/1 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
