192254. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán leukocita és humán gamma interferon egymást követően történő előállítására

1

192 254

2

Találmányunk tárgya eljárás humán leukocita és humán gamma interferon egymást követően történő előállítására.

Találmányunk egyazon sejtpopulációval két lépésben teszi lehetővé az alfa és gamma interferon előállítását, így a korlátozott mennyiségben rendelkezésre álló emberi fehérvérsejt interferon termelő képessége maximálisan kihasználható.

Ismeretes, hogy humán leukocitákban vírusokkal alfa, mitogénekkel pedig gamma típusú interferon állítható elő. A két interferon előállításának korlátja, hogy az emberi leukocjták csak limitált mennyiségben állnak rendelkezésre. A human terápiában mindkét interferonra egyformán szükség van, mivel az egyes interferonok különböző előnyös tulajdonságokkal rendelkeznek (az alfa főleg antivirális, a gamma főleg antitumor hatással), továbbá az interferonok kombinált alkalmazása egymás hatását (antivirális, antitumor, immunomoduláns) potencírozó aktivitása következtében - indokoltnak látszik. Mivel mindkét interferon előállítása a korlátozott mennyiségben rendelkezésre álló leukocitákban történik, az egyik interferon gyártása szűkíti a másik előállításának lehetőségét.

Találmányunk célkitűzése az alfa és gamma interferon egymást követő előállítása ugyanazon fehérvérsejt kultúrában. Régi törekvés, hogy ugyanazon sejtpopulációval alfa-interferont egymás után többször is elő lehessen állítani. Ezen próbálkozások kudarccal végződtek, mivel kiderült, hogy a sejtek által termelt nagy mennyiségű alfa interferon visszahat a sejtekre, azokat hiporeaktív állapotba hozza, vagyis a következő indukció során a sejtek alfa interferont termelő képessége elenyésző.

Találmányunk alapja az a felismerés, hogy a gamma interferont termelő rendszer nagy mennyiségű alfa interferonnal történő kezelést követően sem kerül hiporeaktív állapotba, sőt a tapasztalatok szerint több interferont állít elő, mint a kezeletlen. Ez érvényesül az alfa interferon termelési periódus végén is, mely nagy mennyiségű alfa interferont eredményez és a gamma interferont termelő sejtek interferon termelő képessége megtartott, sőt fokozott.

Találmányunk tárgya eljárás alfa- és gammainterferon előállítására a vér fehérvérsejt-frakciójának (buffy coat) elválasztása, a vörösvértestek eltávolítása, a leukociták megfelelő tápoldatban történő szuszpendálása, majd alfa-interferon induktorral és gamma-interferon induktorral történő kezelése útján, oly módon, hogy az alfa-interferont és gamma-interferont ugyanazon fehérvérsejt kultúrában egymás után termeljük oly módon, hogy a vér fehérvérsejt-frakciójának elválasztása, a vörösvértestek eltávolítása és a leukociták megfelelő tápoldatban történő szuszpendálása után kapott szuszpenziót alfa- vagy beta-interferonnal előkezeljük, valamely alfa-interferon inducerrel érintkezésbe hozzuk, az alfa-interferon-tartalmú folyadékot a sejtektől elválasztjuk, az alfa-interferont kívánt esetben kinyerjük, a sejteket mossuk, megfelelő tápoldatban szuszpendáljuk, valamely mitogén ágenssel kezeljük, a gamma-interferon-tartalmú folyadékot a sejtektől elválasztjuk és a gamma-inter-5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

feront kívánt esetben kinyerjük és kívánt esetben alfa-interferon-mentesítjüic.

A találmányunk tárgyát képező eljárásnál kiindulási anyagként alvadásban gátolt, legfeljebb 48 órán át 0-8 °C-on tárolt emberi vérből származó fehérvérsejteket (buffy coat) alkalmazunk.

Alvadásgátlásra ACD-oldatot (citromsavat és dextrózt tartalmazó oldat) vagy különböző bázisokkal (pl. adeninnel vagy guaninnal) kiegészített ACD oldatot használhatunk. Az összegyűjtött fehérvérsejteket gradiens-centrifugálással (pl. Ficoll vagy Percoll segítségével) vagy előnyösen ammónium-kloriddal történő hemolízissel távolíthatjuk el. Előnyösen járhatunk el oly módon, hogy a koncentrált fehérvésejt szuszpenziót 0,5-1,0%-os, optimálisan 0,83%-os 0-10 °C hőmérsékletű ammónium-klorid oldattal elegyítjük 1:3-20, előnyösen 1:5 térfogat arányban. A szuszpenziót 5-20 percen át, előnyösen kb. 10 percig 0-8 °C-on keveréssel vagy anélkül inkubáljuk. A szétesett vörösvértestektől elválasztjuk a leukocitákat (pl. centrifugálással). Előnyösen járhatunk el oly módon, hogy az ammónium-kloridos kezelést megismételjük úgy, hogy 1 térfogatrész sejtszuszpenzióra 10 térfogatrész ammónium-klorid oldatot alkalmazunk.

~ A tisztított fehérvésejteket ezután valamilyen aminosavakat és vitaminokat tartalmazó szövetkultúra tápoldatban inkubáljuk (pl. Eagle-féle tápfolyadék, RPMI 1640, Dulbecco módosított MÉM, Glasgow módosított MÉM stb.). Előnyösen alkalmazható továbbá az alábbi összetételű, olcsó, autoklávozható tápoldat:

Komponens

kalcium-klorid

kálium-klorid

magnézium-szulfát vagy

ekvivalens magnézium klorid

nátrium-ldorid

nátrium-hidrogén-karbonát

nátrium-dihidrogén-foszfát

glükóz

ferri-nitrát

Mennyiség 175-350 mg/1 300-500 mg/1

175-500 mg/1 5000-7000 mg/1 200-3500 mg/1 30-150 mg/1 500-5500 mg/1 0-0,2 mg/1

A sejtszámot 10®-108, előnyösen 107 sejt/ml értékre állítjuk be.

. A felhasznált tápfolyadékot, illetve tápoldatot valamely állati vagy emberi szérummal vagy gamma, globulin mentesített szérummal egészítjük ki (0,5-10%). A tápfolyadékhoz vagy tápoldathoz valamilyen antibiotikumot is adunk, célszerűen neomicint vagy gentamicint.

Ezután a sejteket alfa vagy béta interferonnal történő kezelésnek vetjük alá. E célra inducermentes nyers, vagy tisztított interferont alkalmazunk 10-500 NE/ml, előnyösen 200-300 NE/ml mennyiségben. Az előkezelés hőmérséklete 35-39 °C, előnyösen 37 °C, időtartama 1-6 óra, előnyösen 2 óra.

A sejteket ezután valamely alfa interferon inducerrel, előnyösen nyers vagy tisztított Sendai vírussal hozzuk érintkezésbe, előnyösen 100-800, különösen előnyösen 400 hemagglutináló egység/ml koncentrációban.

Az indukció időtartama 5-48 óra, előnyösen

15-20 óra, az alkalmazott hőmérséklet 35-39 °C,

i