192185. lajstromszámú szabadalom • Enzimkatalizátor készítmény digitális lanata primer glikozidjainak szekunder glikozodokká történő átalakítására
1 192 185 2 vagy a kivonatot megóvjuk az enzimek bomlásától, ezért vagy frissen kell felhasználni, vagy mélyhűtött állapotban tárolni. A tárolás ideje is a bomlás miatt limitált. A szuszpenzió, illetve a felülúszóként nyert kivonat fagyasztott állapotban maximálisan félévig aktív. Ezért igen hatásos, ha a szuszpenziót, vagy előnyösen a kivonatot egy ismert módszerrel, valamely ismert berendezésben liofizáljuk és a liofizátumot hűvös helyen tároljuk. A liofilizátum legalább egy évig aktivitás csökkenés nélkül eltartható. Ez az idő azért elegendő, mert a következő esztendő- . ben ismét friss csigát alkalmazhatunk. A liofilizátumból vízzel és megfelelő pufferrel (például Triszpuffer, citrát-puffer stb.) az enzimkatalizátor oldat könnyen elkészíthető. A később ismertetett ellenőrző kísérletekhez a „technika állása szerinti” enzim katalizátort is készítünk, azaz előbb kipreparáljuk az emésztőrendszert, majd azt homogenizáljuk. A továbbiakban a teljes csiga bevitelével előállított kivonatot „találmány szerinti”, az emésztőrendszer bevitelével készített kivonatot „technika állása szerinti” kivonatnak nevezzük. A teljes csiga és az emésztőrendszer közötti tömegarányra tekintettel a kétféle kivonat adagjait akkor tekintjük ekvivalensnek, ha a „technika állása szerinti” kivonat emésztőrendszer tartalmának tömege a „találmány szerinti” kivonatban lévő csigatartalom tömegének 5%-a. A találmányunk szerinti enzimkatalizátor készítménnyel például a következők szerint alakíthatjuk át a Digitalis lanata primer glikozidjait szekunder glikozidokká. Digitalis lanata primer glikozidjából indulunk ki - első lépésben tömény kis szénatomszámú alkanolban, célszerűen metanolban mintegy 10-50 mg/ml koncentrációjú törzsoldatot készítünk, amelyet az átalakításhoz kisebb mint 5 mg/ml végkoncentrációra hígítunk. A hígításhoz vizet és olyan puffer oldatot használunk, hogy az oldat pH-értéke 4-7 legyen, optimális (98%-nál nagyobb) kitermelést 5-6 pH-érték mellett kapunk. Ehhez az oldathoz adjuk a Helix pomatia katalizátor készítmény vizes oldatát. Az enzim katalizátort előnyösen 20-30 t%-os oldat alakjában adagoljuk a reakcióelegyhez, oly módon, hogy mennyisége 10-50 mg csiga/mg primer glikozid legyen. Ezután a reakcióelegyet 25-45 °C, célszerűen 32-39 °C, előnyösen 33-37 °C hőmérsékleten 20-120', előnyösen 30-60'-ig inkubáljuk. Az egy órás inkubálás eredményét a hőmérséklet függvényében az 1. ábra szemlélteti, amelyből kitűnik, hogy 37 °C-on az átalakulás gyakorlatilag 100%-os. A 2. ábrán az enzim katalizátor mennyiségének befolyását szemléltetjük 25 °C-on mg csiga/0,5 mg primer glikozid léptékben. Az ábrából kitűnik, hogy kis mennyiségű katalizátor alkalmazása esetén még átalakulatlan, vagy részben átalakult - acetil-, illetve dezacetil - primer glikozid is marad a reakcióelegyben. Az optimális átalakulást 10-50 mg csigából készült enzimkatalizátor/0,5 mg primer glikozid eredményezi. A reakcióparaméterek összefüggésének vizsgálata során azt tapasztaltuk, hogy az átalakulás sebessége 1 óra után sem csökken. Ha tehát az optimális feltételek között 1 órás inkubálás után 50 mg-nyi primer glikozid 1 g-nyi csigából előállított enzimkatalizátor hozzáadásával gyakorlatilag teljes mértékben szekunder glikoziddá alakul, hasonló mértékű átalakulás érhető el akkor is, ha csökkentjük a katalizátor mennyiségét, de megfelelően növeljük a reakcióidőt. Az átalakítást megismételtük oly módon is, hogy a reakcióelegyhez katalizátorként a „találmány szerinti” helyett a „technika állása szerinti” Helix pomatia emésztőrendszerének kivonatát adtuk ekvivalens adagolással. Azt tapasztaltuk, hogy a „technika állása szerinti” katalizátor hatása nem jobb, mint a „találmány szerint” készített kivonaté, ugyanakkor a találmány szerinti eljárásnál a kényes manuális kipreparálási műveletek elhagyhatók, a szükséges csigamennyiség mindkét eljárásnál gyakorlatilag egyező. A találmányunk szerinti enzimkatalizátort heterogén közegben is alkalmazhatjuk, másik ebben az esetben a primer glikozido(ka)t mintegy 10 tf%-os vizes alkanolban, előnyösen metanolban vagy etanolban szuszpendáljuk és a szuszpenzióhoz adagoljuk az enzimkatalizátor készítményt. Célszerűen a szuszpenzió 1-50 mg primer glikozid/ml oldószert tartalmaz. Eljárhatunk azonban oly módon is, hogy első lépésben a rövid szénláncú alkanolban, előnyösen metanolban tömény glikozid oldatot készítünk és ezt a tömény oldatot adagoljuk a Helix pomatia enzimkatalizátor készítményhez (a csiga homogenizátumához illetve a kivonatához). Abban az esetben, ha híg alkanolos szuszpenzióban végezzük az átalakítást, a reakció sebességét a lanatozid-C oldódása szabja meg. Találmányunk szerint a Digitalis növényt, előnyösen a levelét alkalmazzuk kiindulási anyagként. A levelet (fóliumot) súlyára számított, célszerűen 1-5-szörös mennyiségű vízben szuszpendáljuk, majd igen finomra őröljük. A víz mennyiségét az szabja meg, hogy friss (nedves) vagy szárított levelet kívánunk feldolgozni. Friss levél esetén kevesebb, szárított fóliumhoz több vizre van szükségünk ahhoz, hogy a finom szuszpenzió még jól kezelhető (keverhető), de feleslegesen híg se legyen. Az alkalmazott enzimkatalizátor mennyiségét a növény primer glikozid tartalma szerint választjuk meg, előnyösen azonos arányt alkalmazunk, mint a primer glikozidok átalakításánál. A reakció egyéb paraméterei (hőfok, idő stb.) is az oldatban végzett reakcióéval azonosak. Enzimkatalizátor készítményünkkel nemcsak a Digitalis lanata primer glikozidjait alakíthatjuk át szekunder glikozidokká, hanem az egyéb Digitalis fajtákét, így például a Digitalis purpurea-ét is. A találmányunk szerinti készítményt az alábbi példában mutatjuk be részletesen anélkül, hogy oltalmi igényünket arra korlátoznánk. Példa a) Helix pomatia enzlmkatalizátor készítmény 100 g Helix pomatia (éticsiga), 300 ml desztillált víz. Friss vagy mélyhűtött Helix pomatiát használunk (elpusztult, megfeketedett éticsiga nem alkalmas). Házától megfosztott 100 g-nyi csigát 300 ml desztillált vízben szobahőmérsékleten 10 000 ford/ 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
