192165. lajstromszámú szabadalom • Eljárás BBM-1644 jelű antibiotikum előállítására
1 192165 2 szulfáttal telíthetjük a BBM-1644 nyers szilárd formában való kicsapása céljából. E szilárd anyagot vízben oldhatjuk és csapvízzel szemben dializálva sómentesítjük.' A nyers BBM-1644 további tisztítására más savas polipeptidekhez használatos szokványos eljárások alkalmazhatók. Például a BBM-1644-et tartalmazó vizes oldatot ion-cserélőn, mint DEAE-cellulózon,. CM-Sephadexen vagy CM-cellulózon adszorbeáltathatjuk és semleges sóoldattal eluálhatjuk. Előnyösen egymást követő kromatográfiás műveleteket hajtunk végre, eluensként gradiens koncentrációjú sóoldatot használva. A tisztított BBM-1644-et tartalmazó vizes frakciókat azután koncentráljuk, például liofilezéssel szárítjuk. A BBM-1644 fizikai-kémiai tulajdonságai A BBM-1644-et liofilezés útján amorf fehér por alakjában izoláljuk. Nagyfeszültségű papír-elektroforézissel (4500 V 0,05M barbitál-pufferben pH 8,6-nál) a BBM-1644 savként vándorol, 1 óra alatt 8,7 cm-t mozdul el az anód irányába. A BBM-1644-nek nincs éles olvadáspontja és 240 °C felett fokozatosan elbomlik. Vízben oldódik, de gyakorlatilag oldhatatlan szokványos szerves oldószerekben, mint metanolban, etanolban, acetonban, etil-acetátban és «-hexánban. Az antibiotikum optikai forgatóképessége a^6 = = —75,6°, 0,25%-os vizes oldatban. Amint a 2. ábrán látható, a BBM-1644 UV spektruma abszorpciós maximumot mutat 275 nm-nél (Ej^, 8,2) és 310 nm-nél (E|^ 4,6; váll) vizes oldatban. UV spektruma közel azonos vízben és 0,0In HCl-ban, de csak egy maximumot mutat 0,0ín NaOH-ban 285 nm-nél (E|*m 8,9). A BBM-1644 KBr-ban mért IR spektrumát az 1. ábra mutatja. A spektrum -NH és -OH csoportok (3300 ~ 2980 cm'1) és amidcsoportok (1650 és 1540 cm'1) jelenlétét jelzi. Az antibiotikum pozitív reakciót ad Folin-Lowry, xantoprotein, biuret és ninhidrin reagensekkel és elszínteleníti a kálium-permanganát-oldatot. Negatív antron- és Sakaguchi-reakciót ad. Sephadex G-75 oszlopon ovalbuminnal (molekulasúly 43 000), kimotripszinogénnel (25 000) és libonukleáz A-val (13 700) együtt kromatografálva a BBM-1644 közvetlenül a kimotripszinogén után eluálódik és ezért molekulasúlyát körülbelül 22 000-nek tekintjük. A BBM-1644 elemi analízise 46,60% szenet, 6,45% hidrogént, 13,34% nitrogént és 0,20% kenet mutat ki. Aminosav-analízissel 13 fajta aminosav mutatható ki a BBM-1644 molekulában, a 4. táblázat szerint. Bázikus aminosav, mint lizin, hisztidin és arginin nincs jelen a BBM-1644- ben. 4. táblázat BBM-1644 aminosav-összetétele________ Alanin 8,8 Aszparaginsav 6,0 5 Cisztin** 1,0 Glutaminsav 5,7 Glicin 8,7 Izoleucin 2,3 Leucin 1,0 Fenil-alanin 1,4 Prolin 4,1 Szerin 1,6 T reonin 7,2 Tírozin 0,6 Valin 11,1 * A leucin-tartalmat önkényesen I-nek vettük. ** —S—CH2—CH(NH2)—COOH A BBM-1644 meglehetősen stabil a 2 ~ 9 pH tartományban, de stabilitása hirtelen csökken e tartományon kívül. A BBM-1644 vizes oldata 2 óráig stabil 50 °C-on semleges pH-nál. UV-fénynek kitéve a BBM-1644 antibiotikus aktivitása 20 perc alatt elvész. A BBM-1644 fent leírt fizikai-kémiai tulajdonságai azt mutatják, hogy fehérjetermészetű tumorgátló antibiotikum-csoport tagja, a neokarzinosztatinnal, makromomicinnel és auromomicinnel együtt. A BBM-1644 azonban molekulasúlya, aminosavtartalma és papír-elektroforézise alapján elkülöníthető az ismert fehérjetermesztésű tumorgátló antibiotikumtól. A BBM-1644, neokarzinosztatin és makromomicin elektroforetikus mobolitását az 5. táblázat mutatja. 5. táblázat Papír-eleklroforézis* Mobilitás (mm ________________________a felvitel pontjától) BBM-1644 + 87 Neokarzinosztatin + 31 Makromomicin-20 * 4500 V, 1 óra; barbitál-pufíer pH 8.6 Az antibiotikumok neokarzinosztatin-csoportja általában két UV abszorpciós maximumot mutat 275 és 350 nm körül, míg a BBM-1644 UV-maximuma körülbelül 275 és 310 nm-nél van. Újabban leírták [Biochem. Res. Commun. 95, 1351-1356 (1980)], hogy a neokarzinosztatin antibiotikumok 350 nm-nél kapott maximumai nem-fehérje kromofóroknak (színhordozó vegyület) tulajdonítható, melyek alapvetőek a biológiai aktivitás szempontjából. A BBM-1644 kromofórja különbözik az ismert neokarzinosztatin antibiotikum-csoport kromofórjaitól. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
