192129. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az A-41030 jelzésű antibiotikumok előállítására
1 2 fenti 5. táblázat tartalmazza. Az A41030 antibiotikum C faktor ugyanazokban az oldószerekben oldódik, mint az A faktor. A megfigyelt fizikai-kémiai adatok alapján az A41030 C factor szerkezete a (III) képlettel adható meg. 6. példa A41030 D faktor izolálása Az A41030 komplex 6,0 g-ját 200 ml víz/acetonitril/NaCl (83:17:2 g per liter) oldószerben oldjuk, és az oldatot átszűrjük. A szűrletet a laboratóriumunkban a 3. példában leírt speciális eljárással előállított 10—20 mikronos LP-l/Ci* fordított fázisú szilikagél 4 literével megtöltött 8 x 100 cm-es rozsdamentes acél-oszlopra visszük fel. A „Chromatospac Prep-100” egység részét képező oszlopot a minta feloldására használt oldószerrel eluáljuk, és 480 ml-es frakciókat szedünk. Az eluátumot 254 nm-nél „ISCO Model UA—5” UV detektorral ellenőrizzük. Egyes frakciókat a D faktor jelenlétére vonatkozólag analitikai HPLPLC-vel elemzőnk 0,8 x 30 cm-es „Michel-Miller” üveg-oszlopon, melyet laboratóriumunkban 25—40 mikronos LiChroprep RP-8-cal töltöttünk meg. A víz/acetonitril/NaCl (84:16:2 g per liter) oldószert 4 ml/min sebességgel áramoltatjuk át „FMI” szivattyú segítségével. A D faktort 254 nm-nél detektáljuk „ISCO Model UA—5” UV detektort használva. Az 1—34. frakciót elöntjük. A D faktorban dús 35—53. frakciót egyesítjük és csökkentett nyomáson körülbelül 500 ml térfogatra bepároljuk. Két hasonló tisztítási művelet koncentrátumát egyesítjük, vízzel 3 literre hígítjuk és oszlopba (2,8 x x 22 cm) töltött 100 ml Diaion HP-20 gyantára viszszük fel, melyet előzőleg vízzel hoztunk egyensúlyba. Az oszlopot vízzel (300 ml) mossuk, amíg a mosófolyadékban kicsapással kloridion (mint AgCl) már nem mutatható ki. Az eluációt 1 liter viz/acetonitril (6:4) eleggyel hajtjuk végre 8—10 ml/min sebességgel. Az eluátumot csökkentett nyomáson bepárolva és liofilizálva D faktorban feldúsult 2,33 g keveréket kapunk. E keverék 1,5 g-ját 25 ml víz/acetonitril/dibutíl-amin (80:20:0,03M, foszforsawal pH 7,8-ra beállítva) oldószerben oldjuk, az oldódást tetrabutil-ammónium-hidroxid hozzáadásával elősegítve. A mintát 25—40 mikronos LiChroprep RP-8-cal megtöltött 2,8 x 5,9 cm méretű „Michel-Miller” üveg-oszlopra visszük fel, és az oszlopot „FMI” szivattyú segítségével a minta feloldására használt oldószerrendszenel eluáljuk. Az eluátumot 254 nm-nél ellenőrizzük, „ISCO Model UA—5” UV detektort használva. Egyes 25 ml-es frakciókat a D faktor jelenlétére nézve analitikai HPLC-vel elemezzük 4,6 x 25 mm-es rozsdamentes acél-oszlopon, melyet 10 mikronos LiChrosorb RP-18-cal (kereskedelmi forgalomban levő fordított fázisú szilikagél, E. Merck. Darmstadt, NSZK). A mintát „Rheodyne Model 7120” precíziós fecskendővel visszük fel. A víz/acetonitril/dibutil-amin (80:20:0,03^, foszforsavval pH 2,5-re beállítva) oldószert 0,75 ml/min sebességgel vezetjük át „Milton Roy Duplex 'linipump” szivattyút használva. A D faktort 225 nm-nél detektáljuk „ISCO Model 1800" változtatható hullámhosszú UV detektor segítségével. Az eluátum D faktorban dús 2,6—3,4 literét csökkentett nyomáson 300 ml térfogatra bepároljuk. Három hasonló tisztítási művelet koncentrátumát egyesítjük és pH 7,7-ig foszforsavat hozzáadva feloldjuk. Ion-jelzőként NaCl-ot (1 mg per ml) adunk az oldathoz. A mintát oszlopba (2,8 x 22 cm) töltött, vízzel előzőleg egyensúlyba hozott 100 ml Diaion HP-20 gyantán bocsátjuk át 20 ml/min sebességgel. Az oszlopot vizes hangyasawal pH 2,5-re beállított vízzel (300 ml) mossuk, amíg a mosófolyadékban kicsapással kloridion (mint AgCI) már nem mutatható ki. Az oszlopot 1 liter víz/acefonitril (6:4) eleggyel eluáljuk 30 ml/min sebességgel. Az eluátumot csökkentett nyomáson bepárolva és liofilizálva 0,63 g részlegesen megtisztított D faktort kapunk. E preparátumot 15 ml viz/acetonitril/dibutil-amin (80:20:0,03M, foszforsavval pH 7,8-ra beállítva), oldjuk, az oldódást tetrabutil-ammónium-hidroxid hozzáadásával elősegítve. Az oldatot 25-40 mikronos LiChroprep RP-8- on kromatografáljuk 2,8 x 59 cm-es „Michel-Miller” üvegoszlopon, a fentebb leírt módon. Az eluátum 2,5—3,0 literes részét csökkentett nyomáson körülbelül 200 ml térfogatra bepároljuk. E koncentrátumot Diaion HP-20 gyantát tartalmazó oszlopon sómentesítjük a fentebb leírt módon. Az eluátumot csökkentett nyomáson bepárolva és liofilizálva 193 mg részlegesen megtisztított D faktort kapunk. Két részlegesen megtisztított D faktor preparátumot egyesítünk, a minta 259 mg-ját 6 ml víz/acetonitriI/NaH2P04 (82:18:0,03M, foszforsawal pH 7,8- ra beállítva) elegyben oldjuk, és az oldat pH-ját vizes 5 n nátrium-hidroxid-oldattal 10-re állítjuk be. Az oldatot 25—40 mikronos LiChroprep RP-8-cal megtöltött, 2,8 x 59 cm méretű „Michel-Miller” üvegoszlopra visszük fel és „FM1” szivattyút használva az oldatot 4 ml/min sebességgel eluáljuk a minta feloldásához használt oldószerrendszerrel. Az eluátumot 254 nm-nél „ISCO Model UA-5” UV detektorral ellenőrizzük. Egyes 27 ml-es frakciókat a D faktor jelenlétére vonatkozóan elemzünk analitikai HPLC- vel 4,6—150 mm méretű rozsdamentes acél-oszlopon, amelyet laboratóriumunkban 10 mikronos Nucleosil Cjg-cal töltöttünk meg. A mintát „Rheodyne Model 7120” precíziós fecskendővel visszük fel. A prepara~ív eluációhoz használttal azonos oldószerrendszert alkalmazunk „Milton Roy Duplex Minipump” szivatytyú segítségével, 0,6 ml/min sebességgel. A D faktort 225 nm-nél mutatjuk ki „ISCO Model 1800” változtatható hullámhosszú UV detektort használva. Az eluátum 405—1134 ml-es részét csökkentett nyomáson 500 ml térfogatra bepároljuk, és Diaion HP-20 gyantát tartalmazó oszlopon sómentesítjük a korábban leírt módon. Az eluátumot csökkentett nyomáson bepárolva és liofilizálva 120 mg D faktort kapunk. Az A41030 antibiotikum D faktor fehér, amorf, szilárd anyag, melynek hozzávetőleges elemi analízise a következő: 54,46% szén, 4,35% hidrogén, 7,58% nitrogén, 4,27% és — a különbségből — 29,34% oxigén. 66%-os vizes dimetil-formamid-oJdatban a D faktor elektrometrikus titrálása két titrálható csoport jelenlétét mutatja ki körülbelül 5,5, illetve 7,6 pKa értékkel, lehetséges további pKa értékkel 10 felett (kezdeti pH 6,83). Gyors atom-bombázást alkalmazó spektrometriával körülbelül 1326-os molekulatöme192.129 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 10
