192129. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az A-41030 jelzésű antibiotikumok előállítására
1 2 get kapunk. Az A41030 antibiotikum D faktor KBr tablettában felvett infravörös abszorpciós spektrumát a mellékelt rajzok közül a 4. ábra mutatja. A következő megkülönböztethető abszorpciós maximumok figyelhetők meg: 3448—3226 (erős, széles), 2959 (gyenge), 1661 (erős), 1592 (erős), 1511 (erős), 1429 (gyenge), 1290 (gyenge), 1227 (gyenge), 1212 (közepes), 1163 (gyenge), 1143 (gyenge), 1053 (közepes) és 1010 (erős) cm'1. Az A41030 D faktor ultraibolya abszorpciós maximumait semleges, savas és lúgos metanol/víz (1:1) elegyben a fenti 5. táblázat mutatja. Az A41030 antibiotikum D faktor ugyanazokban ■azoldószerekben oldódik, mint az A faktor. 7. példa A41030 E faktor izolálása Az A41030 komplex 0,3 g-ját 30 ml víz/acetonitril/NaCl (85:12:2 g per liter) oldószerben oldjuk és laboratóriumunkban 25—40 mikronos LiChroprep RP-8-cal megtöltött 2,8 x 59 cm-es „Michel-Miller” üveg-oszlopra visszük fel. Az oszlopot 12 ml/min sebességgel (586,6 kPa) „FMI” szivattyú alkalmazásával eluáljuk, a minta feloldásához használt oldószerrendszerrel, és 24 ml-es frakciókat gyűjtünk. Az eluátumot „ISCO Model UA—5” UV detektorral ellenőrizzük 254 nm-nél. Az 1—54. frakciót elöntjük. Az-E faktorban dús 55—122. frakciót egyesítjük és csökkentett nyomáson 50 ml térfogatra bepároljuk. 13 hasonló tisztító művelet koncentrátumát egyesítjük, vízzel 1,5 literre hígítjuk és oszlopba (2,8 x x 22 cm) töltött, vízzel előzőleg egyensúlyba hozott 100 ml Diaion HP-20 gyantára visszük fel 5 ml/min sebességgel. Az oszlopot vízzel (900 ml) mossuk, amíg a mosófolyadékban kicsapással kloridion (mint AgCl) már nem mutatható ki. Ezután víz/metanol (1:1) eleggyel, 10 mi/min sebességgel eluálunk, 300 ml-es frakciókat gyűjtve. A frakciókat B. subtilis elleni aktivitás szempontjából elemezzük. Az 1—8. frakciót egyesítjük, majd csökkentett nyomáson bepárolva és liofilizálva 1,04 g F faktorban dús keveréket kapunk. E keverek 0,5 g-ját 10 ml víz/acetonitril/NaCl (84:14: :2 g per liter) oldószerben oldjuk és 25—40 mikronos LiChroprep RP-8-cal megtöltött, 2,8 x 59 cm méretű „Michel-Miller” üvegoszlopra visszük fel. Az oszlopot „FMI” szivattyú segítségével 5 ml/min sebességgel eluáljuk a minta feloldásához használt oldószerrendszerrel és 25 ml-es frakciókat gyűjtünk. Az eluátumot „ISCO Model UA—5” UV detektor segítségével ellenőrizzük 254 nm-nél. Egyes frakciókat az E faktor jelenlétére vonatkozóan analitikai UPLC—vei elemzünk 4,6 x 150 mm méretű rozsdamentes acéloszlopon, melyet laboratóriumunkban 5 mikronos ODS-Hyperspheres töltettel (Shandon Southern Products, Ltd., Chesire, England) töltöttünk meg. A mintát „Rheodyne Model 7120” precíziós fecskendővel visszük fel. A jégecettel pH 6-ra beállított víz/acetonitril/nátrium-acetát (81:19:2 g per liter) keverékből álló oldószert 0,65 ml/min sebességgel „Milton Roy Duplex Minipump” szivattyúval adagoljuk az oszlopra. Az E faktort 225 nm-nél mutatjuk ki „ISCO Model 1800” változtatható hullámhosszú UV detektor segítségével. Az eluátum 1520—1780 ml-es részét csökkentett nyomáson 50 ml térfogatra bepároljuk. Három hasonló tisztítási művelet koncentrátumát egyesítjük, vízzel 1 litene hígítjuk és 10 ml/min sebességgel oszlopba (2,8 x 22 cm) töltött 100 ml Diaion HP-20 gyantára visszük fel, melyet előzőleg vízzel egyensúlyba'hoztunk. Az oszlopot vizes hangyasawaí pH 2,5-re beállított vízzel (200 ml) mossuk, an iíg a mosófolyadékban kicsapással kloridion (mint AgCl) már nem mutatható ki. Az eluációt 0,5 liter víz/acetonitril (6;4) eleggyel hajtjuk végre 15 ml/min sebességgel. Az eluátumot csökkentett nyomáson bepárolva és liofilizálva 202,2 mg részlegesen megtisztított E faktort kapunk. E preparátumot 4 ml víz/ /ar etonitril/NaCl (86:14:2 g per liter) oldószerben oldjuk és 4 ml/perc sebességgel 25—40 mikronos LiChroprep RP-8-cal megtöltött, 2,8 x 59 cm-es „Michel-Miller” üveg-oszlopon kromatografáljuk, a fentebb leírtak szerint. Az eluátum E faktorban dús 2060—2480 ml részét csökkentett nyomáson 50 ml térfogatra bepároljuk. Három hasonló tisztító művelet koncentrátumát egyesítjük és 100 ml Diaion HP-20 gyantán, oszlopban sómentesítjük, a fentebb leírtak szerint. Az eluátumot csökkentett nyomáson bepárolva és liofilizálva 242 mg E faktort kapunk. Az A41030 antibiotikum E faktor fehér szilárd anyag, melynek megközelítő elemi analízise a következő: 56,6% szén, 4,06% hidrogén, 8,53% nitrogén, 3,50% klór és — a különbségből — 27,85% oxigén. Vizes 66%-os dimetil-formamid-oldatban az E faktor elektrometrikus titrálása két titrálható csoport jelenlétét jelzi, körülbelül 5,8, illetve 7,7 pKa értékkel, lehetséges további pKa értékekkel 10 felett (kezdeti pH 6,57). Gyors atom-bombázást alkalmazó tömegspektrometriával körülbelül 1163-as molekulatömeget kapunk. Az E faktornak kísérletileg a Cj8H46C1N70ig tapasztalati képletet tulajdonítjuk. Az A41030 antibiotikum E faktor KBr pasztillában felvett infravörös abszorpciós spektrumát a mellékelt rajzok közül az 5. ábra mutatja. A következő megkülönböztethető abszorpciós csúcsok figyelhetők meg: 3448—3226 (erős, széles), 1653 (erős), 1600 (közepes), 1504 (erős), 1429 (gyenge), 1290 (gyenge), 1198 (közepes), 1136 (gyenge), 1064 (gyenge) és 1010 (erős) cm’ . Az A41030 E faktor ultraibolya abszorpciós maximumait semleges, savas és lúgos metanol/víz (1:1) elegyben a fenti 5. táblázat tartalmazza. Az A41030 antibiotikum E faktor ugyanazokban az oldószerekben oldódik, mint az A faktor. A megfigyelt fizikai-kémiai adatok alapján az A41030 E faktor szerkezetét a (IV) képlettel szemléltetjük. 8. példa A41030 F faktor izolálása Az A41030 komplex 9,0 g-ját feloldjuk 200 ml viz/acetonitril/NaCl (83:17:2 g per liter) oldószere’egyben és az oldatot szűrjük. A szűrletet 8 x 100 cm-es rozsdamentes acéloszlopra visszük fel, melyet a 3 példában leírt speciális eljárással laboratóriumunkban elkészített 4 liter 10—20 mikronos LP-l/Cu fordított fázisú szilikagélle! töltöttünk meg. A „Chromatospac Prep-100” egység részét képező oszlopot 60 ml/min sebességgel a minta feloldására használt 192.129 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 11
