192129. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az A-41030 jelzésű antibiotikumok előállítására
1 2 közül a 2. ábra mutatja. A következő megkülönböztethető abszorpciós maximumok figyelhetők meg: 3448-3226 (erős, széles), 1635 (erős), 1610 (közepes), 1587 (gyenge), 1515 (erős), 1488 (gyenge), 1429 (közepes), 1290 (gyenge), 1227 (erős), 1139 (közepes), 1064 (erős) és 1010 (erős) cm'*. Az A41030 B faktor UV abszorpciós maximumait semleges, savas és lúgos metanol/víz ( 1:1 ) elegyben a fenti 5. táblázat tartalmazza. Az A41030 antibiotikum B faktor ugyanazokban az oldószerekben oldódik, mint az A faktor. A megfigyelt fizikai-kémiai adatok alapján az A41030 B faktornak a (11) szerkezeti képletet tulajdonítjuk. 5. példa A41030 C faktor izolálása Az A41030 komplex 9,0 g-ját feloldjuk víz/acetonitril/NaCl (83:17:2 g per liter) oldó szere légy ben és az oldatot Ieszűijiik. A szűrletet a 3. példában leírt speciális eljárással a laboratóriumunkban előállított 10— —20 mikronos LP-1/Ci» fordított fázisú szilikagél 4 literével megtöltött 8 x 100 cm-es rozsdamentes acéloszlopra visszük fel. Az oszlopot, amely része egy „Chromatospac Prep—100” egységnek, a minta feloldására használt oldószerrendszerrel 60 ml/min sebességgel eluáljuk, 480 ml-es frakciókat gyűjtve. Az eluátumot 254 nm hullámhosszon „ISCO Model UA—5” UV detektorral ellenőrizzük. Egyes frakciókat analitikai HPLPLC-vel elemzőnk a C faktor jelenlétére vonatkozóan, 0,8 x 30 cm-es „Michel-Miller” üveg-oszlopon, melyet laboratóriumunkban 25—40 mikronos „LiChroprep RP-8"-cal töltöttünk meg. A víz/acetonitrii/NaCl (84:16:2 g per liter) oldószerelegyet 4 ml/min sebességgel vezetjük át „FMI” szivattyú segítségével. A C faktort 250 nm-nél detektáljuk, „1SCO Model UA-5” UV detektort használva. Az 1—27. frakciót elöntjük. A C faktorban dús 28—52. frakciót egyesítjük és csökkentett nyomáson 500 ml térfogatra bepároljuk. Két hasonló tisztítási eljárással kapott koncentrátumot egyesítünk, szűrünk és 10 ml/min sebességgel vízzel előzőleg kiegyensúlyozott 100 ml Diaion 1IP-20 gyantán (2,8 x 22 cm oszlopban) bocsátunk át. Az oszlopot vízzel (2 liter) addig mossuk, amíg a mosófolyadékban kicsapással kloridion (mint AgCl) már nem mutatható ki. Az eluációt 1 liter víz/acetonitril (6:4) eleggyel hajtjuk végre 15 ml/min sebességgel. Az eluátumot csökkentett nyomáson bepárolva és liofilizálva C faktorban feldúsult 2,75 g keveréket kapunk. E keverék 1,25 g-ját 25 ml víz/acetonitril/ /dibutil-amin oldószerben (80:20:0,03 M, foszforsavval pH 7,8-ra beállítva) oldjuk, az oldódást tetrabutil-ammónium-hidroxid hozzáadásával segítjük elő. A mintát 25-40 mikronos LiChroprep RP-8-cal megtöltött, 2,8 x 59 cm-es „Michel-Miller” üveg-oszlopra visszük fel és az oszlopot a minta feloldására használt oldószerrendszerrel eluáljuk 4 ml/min sebességgel, ,,FMI” szivattyút használva. Az eluátumot 254 nm hullámhosszon ellenőrizzük „ISCO Model UA-5” UV detektor segítségével. Egyes 28 ml-es frakciókat a C faktor jelenlétére nézve elemzünk analitikai HPLC-vel, 10 mikronos „Nucleosil Cj»”cal (kereskedelmileg forgalmazott fordított fázisú szilikagél, Rainin Instrumetnt Co., Inc., Wobum, MA 01801) laboratóriumunkban megtöltött 4,6 x 150 mm-es rozsdamentes acél-oszlopon. A mintát „Rheodyne Model 7120” precíziós fecskendővel visszük fel. A víz/acetonitril/nátrium-acetát (81:19:2 g per liter, jégecettel pH 6-ra Beállítva) oldószert 1 ml/min sebességgel adagoljuk „Milton Roy Duplex Minipump” szivattyú segítségével. A C faktort 225 nm-nél detektáljuk „ISCO Model 1800” változtatható hullámhosz- S/ú UV detektort használva. Az eluátum C faktorban dis 4,2—5,1 literét csökkentett nyomáson 500 ml térfogatra bepároljuk. Három hasonló tisztítási művelet koncentrátumát egyesítjük és pH 1,7-ig foszforsavat hozzáadva feloldjuk. Ion-jelzőként nátrium-kloridot (1 mg per ml) a lünk az oldathoz. A mintát oszlopba (2,8 x 22 cm) töltött, vízzel előzőleg egyensúlyba hozott 100 ml Diaion HP-20 gyantán bocsátjuk át 20 ml/min sebességgel. Az oszlopot 2,5 pH-jú vizes hagyasavval (100 ml) mossuk, amíg kicsapással kloridion (mint AgCl) már nem mutatható ki. Az oszlopot 1 liter víz/ /acetonitril (6:4) eleggyel eluáljuk 30 ml/min sebességgel. Az eluátumot összegyűjtve, csökkentett nyomásán bepárolva és liofilizálva részlegesen tisztított C faktort kapunk. E preparátumot 20 ml víz/acetonitril/ / iibutil-amin (80:20:0,03M, foszforsawal pH 7,8-ra beállítva) oldószerben oldjuk, az oldódást tetrabutil-immónium-hidroxid hozzáadásával elősegítve. A mintát 25—40 mikronos LiChroper RP-8-on 2,8 x x 59 cm-es „Michel-Miller” üveg-oszlopban kromatografáljuk, a már leírtak szerint. Az eluátum 2,45— —3,20 literét csökkentett nyomáson 500 ml-re bepároljuk. Két hasonló tisztítási művelet koncentrátumát egyesítjük és Diaion HP-20 gyantát tartalmazó osz'opon sómentesítjük, a fentebb leírt módon. Az eluátumot csökkentett nyomáson bepárolva és liofilizálva 688 mg C faktort kapunk. E preparátum 678 ng-ját 60 ml víz/acetonitril (6:4) elegyben oldjuk me’egítés közben. Az oldatot lehűtjük és a C faktort további fagyasztással kicsapjuk. A csapadékot leszűrve, acetonnal mosva és vákuumban szárítva 428 mgC faktort kapunk. Az A41030 antibiotikum C faktor fehér szilárd anyag, melynek hozzávetőleges elemi analízise a következő: 48,87% szén, 4,39% lúdrogén, 6,16% nitrogén, 6,96% klór és 33,81% oxigén. 66%-os vizes dimetil-formamíd-oldatban a C faktor elektrometrikus titrálása két titrálható csoport jelenlétét mutatja, mintegy 5,5, illetve 7,1 pKa értékkel, és további lehetséges pKa értékeket 10 felett (kezdeti pH 6,6). Gyors atom-bombázást alkalmazó tömegspektrometriával 1393 körüli molekulasúlyt kapunk. Az elemi analízis és a talált molekulasúly alapján a C faktornak a Cé4Hs4Cl3N7023 tapasztalati képletet tulajdonítjuk. Az A41030 antibiotikum C faktor KBr pasztillában felvett infravörös abszorpciós spektrumát a mellékelt rajzok közül a 3. ábra mutatja. A következő megkülönböztethető abszorpciós maximumok figyelhetők meg: 3448—3226 (erős, széles), 1653 (erős), 1587 (gyenge), 1504 (erős), 1481 (gyenge), 1429 (közepes), 1220 (erős), 1136 (erős), 1064 (gyenge), 1053 (közepes) és 1005 (erős) cm‘*. Az A41030 C faktor UV abszorpciós maximumait semleges, savas és lúgos metanol/víz (1:1) elegyben a 192.129 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 9
