192129. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az A-41030 jelzésű antibiotikumok előállítására
1 2 192.129 NRRL 15156 ferde agarban való tenyésztéséhez: Adalékok Mennyiség (g/liter) Dextrin1 10,0 Élesztőkivonat 1,0 Enzimmel hidrolizált kazein2 2,0 Marhakivonat 1,0 Kobalt-klorid—víz (1/6) 0,01 Agár 20,0 Ionmentesített víz 1 literig gyolíb térfogatú tenyészet előállítására szolgáló vegetatív táptalajéval. NRRL 15156 fermentálása 50 ml szaporító táptalajt beoltunk 1% (0,5 ml) fenti vegetatív táptalajjal. A szaporító táptalaj öszszetítele: Adalékok Mennyiség (g/liter) 1 Matheson Coleman and Bell, Norwood, Ohio 45212 1 N-Z-Amine A (Humko Sheffield Chemical Co., Memphis, Tenn.). A kapott táptalaj pH-ja 6,5. A pH-t 5 n vizes nátrium-hidroxid-oldattal autoklávozás előtt 7,3-ra állítjuk be. Autoklávozás után a táptalaj pH-ja 6,9. Mindkét mikroorganizmus spóráit, illetve micélium-töredékét, a fenti adalékokat tartalmazó ferde agarba oltjuk be, ésezt a ferdeagart körülbelül 6 napig mintegy 30 °C-on inkubáljuk. Az érett ferde agar-tenyészetet ezután steril desztillált vízzel lefedjük és steril eszközzel kaparjuk a spórák és a micélium fellazítása céljából. A kapott szuszpenzió 2 ml-ét használjuk 50 ml vegetatív táptalaj beoltására. A vegetatív táptalajhoz inokulumot úgy is előállíthatunk, hogy a vizes szuszpenziót liofilizált pellettel helyettesítjük. Az NRRL 12525 tenyésztéséhez használt vegetatív táptalaj összetétele: Adalékok Glükóz Szójababdara (vagy szójababliszt) Kukoricalekvár Kalcium-karbonát Csapvíz Mennyiség (g/liter) 20,0 15.0 10.0 2,0 1 literig Az NRRL 15156 tenyésztéséhez használt vegetatívtáptalaj összetétele: Adalékok Mennyiség (g/íiter) Dextrin1 30,0 Szójababdara 6,0 Dikálium-hidrogén-foszfát 1,0 Vas(II)-szulfát — víz (1/7) 0,005 Magnézium-szulfát — víz (1/7) 1,0 Nátrium-nitrát 1,0 Kalcium-karbonát 2,0* Ionmentesített víz 1 literig 1A dextrin tápióka- vagy burgonya-dextrin lehet. 2 Az NRRL 12525 fermentációjához a kalcium-karbonát koncentrációja 4,0 g/liter 25 A dikálium-hidrogén-foszfátot vízben oldjuk, az oldatot külön sterilizáljuk, és az oldat szükséges menynyiségét hozzáadjuk a táptalaj többi, már autoklávozott adalékához. A beoltott 50 ml fermentáló táptalajt 250 ml-es Erlenmeyer-lombikban körülbelül 30 °C-on mintegy 4-5 napig inkubáljuk 2,1 cm átmérőjű ív körül percenként 250 forgást végző rázógépen. A Streptomyces Virginiáé NRRL 12525-öt szintén inkubáljuk, üzemi szintű fermentálást végezve 165 literes es 7200 literes tankokban, a fent leit szaporl- 35 tó táptalajt használva. A beoltott szaporító táptalajt 100 liter tápfolyadékot tartalmazó 165 literes fermentáló tankba inkubáljuk 210 óráig (8,75 nap) körülbelül 32 °C-on. A fermentációs táptalajt 0,25 v/v/min steril levegővel levegőztetjük és szokványos keverőkkel körülbelül 40 200 fordulat/min sebességgel keverjük. Az NRRL 12525 ezen üzemi szintű fermentálása képezi azt a forrást, melyből az A41030 antibiotikumokat szeparáljuk, az alább leírtak szerint. Glükóz 15,0 Dextrin 20,0 Szójababdara (vagy szójababliszt) 15,0 Kukoricalekvár 10,0 Kalcium-karbonát 2,0 Csapvíz 1 literig A táptalaj pH-ja a beállítás előtt 5,5. Autoklávozás előtt a pH-t 6,5-re állítjuk be 5 n vizes nátrium-hidroxid-oldattal. A táptalaj pH-ja autoklávozás után 7,0. Mindkét vegetatív inokulumot 50 ml táptalajt tartalmazó 250 ml-es bőnyakú Erlenmeyer-lombikban inkubáljuk mintegy 30 °C-on, körülbelül 48 óráig, 2,1 cm átmérőjű ív körül percenként 250 forgást végző rázógépen. Ezt az inkubált táptalajt vagy kis fermentorok beoltására használjuk (az inokulum a fermentátor táptalajának megközelítőleg 1 térfogatszázaléka), vagy pedig egy második fokozatú táptalaj beoltására, melynek összetétele azonos egy na-45 2. példa Az A41030 antibiotikumok szeparálása Az 1. példában leírt módon kapott teljes fermentlevet (4215 liter) szűrési sebédanyagot (Hyflo crt Supercel diatómaföld, Johns-Manvillr Products ou . Corporation) használva szűrőprésben átszűrjük. Az átszűrt folyadékot 100 liter Diaion HP-20-at (gyöngy-formájú, erősen pórusos sztirol/DVB kopolímer, Mitsubishi Chemical Industries, Ltd., Tokio, Japán) tartalmazó oszlopon bocsátjuk át 4 liter/mln átfolyá- 55 si sebességgel. Az oszlopot egymás után 300 liter vízzel és 1000 liter metanol/víz (1:3) eleggyel mossuk 4 liter/min ütemben. Az eluációt metanol/víz (1:1) eleggyel hajtjuk végre 6 liter/min sebességgel, 100 literes frakciókat gyűjtve. Minden frakció biológiai aktivitását meghatározzuk. A biológiai értékmérést 60 papírkorongos módszerrel hajtjuk végre B. subtilis-6
