192129. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az A-41030 jelzésű antibiotikumok előállítására
1 2-szel beoltott agarlemezeken. Az 1. frakciót elöntjük. A 2—15. frakciót egyesítjük, csökkentett nyomáson bepároljuk, és a maradékot liofilizálva 200 g nyers antibiotikus komplexet kapunk. E komplex egy részét, 110 g-ot, 5 liter metanol/víz (1:1) elegyben oldjuk, a pH-t vizes nátrium-hidroxid-oldattal 10-re állítjuk be, és a keveréket átszűrjük. A szűrletet 50 ml/min sebességgel durva szemcsés Sephadex G-50 (dextrán térhálósítása útján előállított hidrofil, oldhatatlan, molekulaszita kromatografáló anyag, Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ 08854) előzőleg metanol/víz (1:1) eleggyel egyensúlyba hozott 30 literes oszlopára (0,2 x 1 m) viszsziik fel. Az oszlopot metanol/víz (1:1) eleggyel eluáljuk 50 ml/min sebességgel és 3 literes frakciókat gyűjtünk. Az 1—12. frakciókat elöntjük. A B. subtilis-szel szemben aktív 13—24. frakciót egyesítjük, csökkentett nyomáson bepároljuk és liofilizálva 35,7 g A41030 antibiotikum komplexet kapunk. A találmány szerint előállított antibiotikus anyagokat önkényesen A41030 antibiotikumokként jelöljük meg. Az A41030 A, B, C, D, E, F és G faktoroknak nevezünk. A hasznosság tárgyalásakor a rövidség kedvéért az „A41030 antibiotikum” elnevezést fogjuk használni az A41Û30 komplexből és az A41030 A, B, C, D, E, F és G faktorokból álló csoport valamely kiválasztott tagjának megjelölésére. 7 antibiotikus faktort nyertünk ki a fermentációból keverék, az A41030 komplex formájában. Nyilvánvaló, hogy az A41030 komplexben a faktorok aránya változni fog, függően az alkalmazott fermentálási körülményektől. Az egyes A, B, C, D, E, F és G faktorokat szeparáljuk, és egyedi vegyületekként izoláljuk, a későbbiekben leírtak szerint. Az A41030 komplex oldódik oldószerekben, mint vízben, híg vizes savban, híg vizes lúgban, metanol/víz elegyekben, etanol/víz elegyekben, dimetil-formamidban és dimetil-formamid/víz elegyekben, dimetil-szulfoxidban, dímetil-szulfoxid/víz elegyekben, acetonitrilben, acetonban, etil-acetátban, tetrahidrofuránban vagy metilén-kloridban. A következő szakaszokban ismertetjük az A41030 faktorok szeparálását, valamint eddig jellemzett fizikai és színképi tulajdonságait. 3. példa A41030 A faktor izolálása A 2. példa szerint kapott A41030 komplex 8 g-os részét feloldjuk 200 ml viz/acetonitril/NaCl (84:16:2 gr per liter) oldószerelegyben és szűrjük. A szűrletet 4 liter 10—20 mikron szemcseméretű LP-l/Cjt fordított fázisú szilikagéllel megtöltött rozsdamentes acél-oszlopra (8 x 100 cm) visszük fel, a szilikagélt laboratóriumunkban a 4,299,763. számú Amerikai Egyesült Allamok-beli szabadalmi leírás 6. és 7. példájában leírt speciális módszerrel állítjuk elő. Az oszlop részét képezi egy „Chromatospac Prep-100” egységnek (Jobin Yvon, 16—18 rue du Canal, 91160 Longjumeau, Franciaország). Az oszlopot 60 ml/min átfolyási sebességgel eluáliuk víz/acetonitril/NaCl 84:16:2 g arányú eleggyel, 480 ml-es frakciókat gyűjtve. Az eluátumot „ISCO Type 6” optikai rendszert tartalmazó ISCO Model UA—5 UV monitorral (Instrumentation Specialities, Co., Lincoln, NE 68505) ellenőrizzük 254 nm hullámhosszon. Az egyes frakciókat az A faktor jelenlétére vonatkozólag elemezzük analitikai nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával (HPLC)'4,6 x 250 mm rozsdamentes acél-oszlopon, melyet laboratóriumunkban a fent említett speciális eljárással előállított 10 mikronos LP-l/Clt szilikagéllel töltöttünk meg. A mintát „Rheodyne Model 7120” precíziós fecskendővel (Rheodyne Inc., Berkeley, CA 94710) visszük fel. A víz/acetonitril/ /NaCl (81:19:0,03 M) oldószerelegy pH-ját jégecettel 6-ra állítjuk be és „Milton Roy Duplex Minipump” (Laboratory Data Control, Division of Milton Roy Co., Riviera Beach, FL 33404) segítségével áramoltatjuk át az oszlopon 1 ml/min sebességgel (8280 kPa). Az A faktort „ISCO Model UA-5” UV detektorral mutatjuk ki 254 nm-nél. Az 1-51. frakciót elöntjük. Az A faktorban dús 52—79. frakciót egyesítjük és csökkentett nyomáson 500 ml térfogatra bepároljuk, pH-ját vizes nátrium-hidroxid-oldattal 8,2-re állítjuk be és átszűrjük. A szűrletet 15 ml/min sebességgel oszlopba (2,8 x 22 cm) töltött, előzetesen vízzel egyensúlyba hozott 100 ml Diaion HP-20 gyantára visszük fel. Az oszlopot vízzel mossuk (400 ml, hangyasavval pH 2,5-re beállítva), amíg a mosófolyadékban kloridion (AgCl formájában) már nem mutatható ki. Az eluációt víz/acetonitril (8:2) eleggyel hajtjuk végre 15 ml/min sebességgel, 1 literes frakciókat gyűjtve. Megvizsgáljuk a frakciók B. subtilis elleni aktivitását. A kristályos A faktort, amely lehűléskor a 2. reakcióban képződött, szűréssel kinyerjük (389,6 mg). Az 1. frakciót és a 2. reakció szürletét csökkentett nyomáson bepárolva és liofilizálva 731,8 mg, illetve 514 mg A faktort kapunk. Az A41030 antibiotikum A faktor fehér, kristályos szilárd anyag. Elemi analízise a következő: 56,4% szén, 3,58% hidrogén, 8,11% nitrogén, 23,20% oxigén és 8,29% klór. Tér-deszorpciós és plazma-deszorpciós tömegspektrometriával meghatározva az A41030 A faktor molekulasúlya 1231. Az elemi analízis és a molekulasúly alapján a CjiHmCIjNtOh tapasztalati képlettel írjuk le az A faktort. Az A faktor elektrometrikus titrálása 66%-os vizes dimetil-formamid-oldatban három titrálható csoport jelenlétét mutatja, körülbelül 5,53, 7,60 és 10,37 pKa értékekkel, valamint lehetséges további pKa értékeket 10,5 felett (kezdeti pH 7,83). Az A41030 antibiotikum A faktorának fajlagos forgatóképessége: aff = —19,6° (c=9,0, dimetil-szulfoxidban) Az A41030 /A faktor KBr pasztillában felvett infravörös abszorpciós spektrumát a mellékelt rajzok közül az 1. ábra mutatja. A következő megkülönböztethető abszorpciós maximumok figyelhetők meg: 3448—3226 (erős, széles), 1653 (erős), 1610 (gyenge),. 1587 (közepes), 1515 (erős), 1488 (gyenge), 1429 (közepes), 1227 (erős), 1139 (közepes), 1064 (erős) és 1010 (erős) cm1. Az A41030 A—G faktorok UV abszorpciós maximumait metanol/víz (1:1) elegyben savas, semleges és lúgos körülmények között az 5. táblázat mutatja. 192.129 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 7
