192068. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szabad és antitesthez kötött ligandum szétválasztására
1 192.068 2 A találmány tárgya egy univerzális eljárás a szabad és a/, antitesthez, kötött.jelzett antigének, illetve haptének szétválasztására, amely minden ligandum-immun meghatározási rendszernél alkalmazható, amely elsősorban biológiailag aktív anyagok, így hormonok, enzimek vagy farmakonok mennyiségi meghatározására alkalmas 10~13 mól/liter koncentráeióig leinenően, többnyire test folyadékokban. A találmány legszélesebb alkalmazási területe a radioaktív immun meghatározás (radioimunoassay — RIA) és az enzim-immun-meghatározás (EIA). A raidoimmun meghatározás (RIA) Yalow és Berson által (J. Clin. Invest. 39(1960), 1157)szériuminzulin-meghatározásra történt bevezetése óta napjainkig 200 fölött van azoknak az anyagoknak a száma, amelyeknek meghatározását ligamdun-immun-meghatárzási módszerrel irodalmi közlemények ismertetik. Ezen eljárások a jelzett ligandum (XL) százalékos megkötődésének a mérésén alapszanak, vagyis annak a meghatározásán, hogy a ligandumspecifikus antitest (AKt ) — a jelöletlen ligandum (L) ismeretlen és meghatározandó koncentrációjának a függvényében — mekkora százalékban köti meg a jelölt ligandumot. Valamennyi módszernél beáll a ligandumspecifikus immunreakció alábbi egyensúlya: • jelzett ligandum antitest (*L) ♦ (AK,) - xL-AKj + XL (B) (F) ismerteién koncentrációjú jelöletlen ligandum (L), XL és AKj koncentrációját egy inkubációs feltétben állandón tartják. Az egyensúly beállása után szükség van a szabad (F) és az antitesthez kötött (B) jelzett ligandum szétválasztására. Miután az immunkomplex maga oldható, erre különböző elválasztási eljárásokat dolgoztak ki, de ennek ellenére sem született mostanáig egyetlen, minden téren előnyösen alkalmazható eljárás. Ebből következőleg a publikált radioimmun meghatározok és a kereskedelmi forgalomba hozott RIA-kittek (készletek, összeállítások) eljársai közötti legnagyobb különbségek a B és az F elválasztásának a kivitelezésében vannak. Az elválasztást a lehető legkvantítatívabban kell végezni; ezen keresztül lehet egy RIA alsó meghatározási küszöbértékét és pontosságát lényegesen befolyásolni. Az elválasztás módszerének összeegyeztethetőnek kell lennie a nagy analizissebességgel. A ligandumspecifikus immunreakció egyensúlyának az elválasztás következtében nem szabad észrevehető mértékben megváltoznia. Miután ezeket a követelményeket gyakran igen nehéz betartani, különféle elválasztási módszereket dolgoztak ki. így — a B és F eltérő mobolitását kihasználva — alkalmaznak elektroforézist, kromatográfiát és ultracentrifugálást. Ezeknek a módszereknek a hátrányai az egyensúly erős megzavarása, a nagy időigény és a csekély analizissebesség. Elválasztás érhető el oly módon is, ha B-t etanollal, dioxánnal, polietilénglikollal 125 g/1 koncentráció mellett vagy 215 g/1 koncentrációjú ammónium-szulfáttal kicsapják. Az első két, máskülönben elegáns eljárásnak az a hátránya, hogy emelkedő fehérjetartalom mellett a jelölt szabad ligandum (F) is egyre inkább leválik az immunkomplexszel együtt. Ráadásul az alacsonyabb aktivitással rendelkező antitestek immunkomplexei elhasadnak. Az elkülönítési eljárások egy másik csoportja a szabad ligandumok (F) adszorpcióján alapszik; adszorbensként aktívszenet, ioncserélő gyantákat, cellulózt vagy szilikátokát alkalmaznak. E módszerek hátránya az, hogy részlegesen B is adszorbeálódik, s emellett a kötődés mértéke a közegtől függ. Egy további lehetőség a ligandumspecifikus antitestkémiai úton való rögzítése a reakció előtt, például egy cellulóz- vagy egy Sepharose-mátrixon (solid-phase-method), illetve az inkubációs csövecske belső falán (tube-method); ennek alkalmazása esetén egy közönséges centrifugális, illetve egyszerű dekantálás is elegendő az elválasztáshoz. Ezeknek a-módszereknek a hátránya az, hogy az immobilizált antitestek többnyire affinitásukat tekintve csökkent értékűek, s ezáltal a RIA veszít az érzékenységéből. Az általában drága, specifikus antitestek (AKi) felhasználása a fixálás következtében a többszörösére növekszik. Ráadásul az inkubációs csövecskéket az inkubáció folyamán állandóan mozgatni kell, mivel a reakciófázisok bennük heterogén elegye t képeznek. Valamennyi eddig említett módszer fiziko-kémiai jellegű. Az elválasztási eljárások egy további csoportját „kettős antitest-módszerek” elnevezéssel szokás egybefoglalni. Ezen eljárás alkalmazásakor a B és F elkülönítése egy másik antitest (AK2) közbejöttével megy végbe, amely a donorszervezet AK^-re specifikus immunglobulinjával szemben mutat fajlagosságot, s az az oldható XL-AK( immunkomplexet az oldatból kicsapja. Miután az AKt nagyon alacsony koncentrációban (az ellenszérum hígítása 1:103 — 1:106) kerül alkalmazásra, ezért az AKj antitestet adó donorszervezet normálszérumát (NS) mintegy 1:100 hígításban adják az inkubátumhoz Az NS AK2-höz viszonyított koncentrációarányát úgy állapítják meg, hogy maximális immunprecipitációt érjenek el. A precipitáció lejátszódása után B-t lecentrifugálják. A kettős antitest technika adja a legjobb elválasztást B és F között és a nemspecifikus precipitáció (őu) igen alacsony fokú. A hátránya e módszernek abban áll, hogy az xJL-AKj és az AK2 közötti kötés létrejöttét egyes páciensek immunglobulinjai kompetitive gátolják (Brunfeldt, K. és Jörgensen, K.R., Acta Endocrin 54 (1967), 347) s ezáltal hamisan magas mérési eredményeket kapnak L plazmabeli koncentrációjára. Ezenfelül a precipitációt a komplement mennyiségileg befolyásolja. Az említett hárányok kiküszöbölésére az úgynevezett kötőreagenssel, a specifikus AKj AK2-vel előzetesen képzett precipitátumával normálszérum hozzáadásával dolgoztak (Hales, C.N. és Randle, PJ. Biochem. J., 88 (1963), 137). Ez esetben megmaradt a csekély mértékű Bu előnye,az immunglobulin keresztreakciója az AK2-vel valamint a komplementhatás ugyancsak messzemenően meg van akadályozva, de ugyanakkor feladták azt az előnyt, amit a ligandumspecifikus immunreakció homogén reakciófázisban való elvégzése jelent. Egy másik variáns leírása található meg den Hollander munkájában (den Hollander és mtsai, J. of Immunol. Methods, 1,(1972), 247). Eszerint az AK2-t egy szilárd hordozóhoz rögzítik és az XI^AK, immunkomplexet immunadszorpció révén választják el a jelzett szabad ligandumtól (XL). Miután a rögzített AK2-t fölöslegben lehet alkalmazni, az immunglobulin AK2-vel adott keresztreakdója és a komplementreakció nincsenek hatással az XL-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
