192068. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szabad és antitesthez kötött ligandum szétválasztására
1 192.068 2 AK, kvantitatív megkötődésére. A módszer hátránya abban mutatkozik meg, hogy a hordozóhoz való kémiai rögzítés folytán az AK2 antitest egy jelentős hányada inaktiválódik, elveszti aktivitását, miáltal az AK2 -felhasználás megnövekszik. Másrészről a szilárdfázishoz kötött AK2 nem stabilis: néhány napos eltartás után már szabad AK2 -t lehet kimutatni, minek következtében azután hamisan magas értékek adódnak az L ligandum meghatározandó koncentrációjára nézve, továbbá a szilárd fázis jelenléte miatt anamspecifikus kötődés mértéke megnőhet. Ehhez járul még az, hogy a hodozóhoz való rögzítés következtében bizonyos fokig áttekinthetetlen és nem szabályozható reakciók játszódnak le és ezáltal a kapcsolási hozam és az inaktiválódás foka s evvel együtt a szilárdfázisú AK2 kötőképességének mértéke az AK,-gyel szemben tág határok közötti változásoknak van kitéve. Ám a legnagyobb hátrány magában a módszer kivitelezésében van, mert az egész inkubációs periódus folyamin (ez néhány órát tesz ki) az XL-AK, kötés kialakulásához a próbacsöveket folyamatosan rázatni kell. Találmányunk célja egy univerzális eljárás bevezetése a szabad (F) és az antitesthez kötött (B) ligandum elkülönítésére a például hormonok, enzimek, farmakonok, speciális fehérjék és más anyagok meghatározására előnyösen alkalmazható ligandum-inimun meghatározási rendszerek eszköztárába, amely túlnyomórészt biológiai, de egyéb közegekben is - a ligandum jelölésének módjától függetlenül - nyerhet alkalmazást (radioimmun meghatározás, enzim-immun-meghatározás és más, immunreakción alapuló meghatározások). A klinikai-biokémiai kutatásban az ismeretszerzés nélkülözhetetlen előfeltétele a nagyon specifikus, érzékeny analitikai technikák alkalmazása, ezért a még mindig igen drága analitikai próbák kivitelezéséhez szükséges eszköz-összeállítás ok (tesztkészletek) iránti igény továbbra is nagy. A találmány szerinti univerzális elválasztó eljárás bevezetésével az immunpróba kivitelezésében szabányosítás lenne elérhető, s ez jelentős költségmegtakarítással párosulna. A találmány lényegét annak a fealdatnak a megoldása képezi, hogy egy új, egyetemlegesen alkalmazható eljárást dolgozzanak ki a szabad (F) és az antitesthez kötött (B) ligandum elkülönítésére, mely a radio-, enzim-, spinjelzett vagy általánosságban a jelölt ligandumokat alkalmazó immunanalizisben egyaránt felhasználható. A találmány szerinti új elválasztási eljárást az jellemzi, hogy a kettős-antitest módszert - előnyeinek megtartása mellett - úgy módosítottuk, hogy egyúttal a szilárdfázisos eljárás előnyeit is kamatoztassuk: megtartva így a homogén reakciófázist az immunreakció kivitelezésénél, anélkül azonban, hogy az AK, ligandumspecifikus antitesthez kötődő AK2 második antitestet kémiailag rögzítenénk valamely hordozón s ezáltal AK2 az aktivitást részben elveszítené. A különböző elválasztási eljárások fentiekben említett előnyeinek kombinálása azáltal sikerül, hogy a ligandumspecifikus immunreakció homogén, cseppfolyós közegben való lejátszódása az XL—AK, oldható immunkomplexet egy finomdiszperz immunprecipitátum (immun-immobilizált csapadékképző reagens = IIPR) hozzáadásával megkötjük. Az IlPR-t az AK2 antitest egy AK! antitestet adó szervezet normálszérumával végrehajtott immunprecipitáció útján állítjuk elő. Az oldható immunkomplex megkötődését az alábbi egyenlet fejezi ki: XL-AK, (H) • xl (F) • IIPR-XL AK, IIPR 1(B) ♦xLi(F) Egy mindössze 30 perces, IIPR-rel történő inkubáció után minden egyes próbacső tartalmát 2 ml anirnóniumszulfát-tartalmú tesztpufferrel elegyítjük, miáltal az (NH4)2S04 végkoncentrációja 1,16 móllliter értéket kell hogy elérjen. További 30 perc állás után a próbacsöveket 15 percig 2000 g-vel centrifugáljuk. A preparátum egy további mosására rendszerint nincs szükség. Ammónium-szulfát helyett polietilénglikol 6000 ♦Merck, Darmstadt) 30 g/1 végkoncentrációban történő alkalmazására is sor kerülhet. Az IIPR-t célszerűen nagyban (többezer ampulla) állítjuk elő. Az optimális koncentrációviszonyt az AK, - fajtaazonos normálszérum (NS) és a második ellenszérum (AK2) között, mely utóbbi ellenszérum az AK,-fajtaazonos immunglobulinnal lép reakcióba, előzetesen kísérletekkel állapítjuk meg. E kísérletekhez például az alábbi munkamenetet alkalmazhatjuk: 0,1 ml 1:400 normálszérum-hígítás és 0,1 ml Az AK2 higításisor(l 2-től 1:1000-ig) valamely tagjának elegyét 1 órán keresztül szobahőmérsékleten inkubáljuk; ezt követően 0,2 ml xL-AK,-inkubátumot hozzáadunk és 30 perces, szobahőmérsékleten történő inkubáció után az inkubátumot 2,0 ml 1,4 mól/liter ammóniumszulfát-koncentrációjú tesztpufferrel elegyítjükés további 30 perces állás után 2000 g-vel 15 percig centrifugáljuk. A felülúszót kiöntjük, a csapadék aktivitását lemérjük. Abból az AK2 hígításából, amely az XL-AK2 maximális kötődését biztosan garantálja, fogjuk az optimális NS/AK2 arányt az IIPR nagybani előállításához meghatározni. Annak érdeké ben, hogy az IIPR egyenletesen jó kötő és csapadékképző tulajdonsága megmaradását biztosítani tudjuk, a két komponenst a találmány értelmében egy ugyanazon ampullába úgy töltjük le és liofilézzük, hogy az egyiknek a másikkal való reakciója az IIPR alkalmazásáig kizárt legyen. Ampullánként mintegy 0,5 ml AK2-t mélyfagyasztunk, majd minden egyes ampullába 0,05 ml normálszérum-hígítást pipettázunk. A normálszérum azonnal megfagy, anélkül, hogy a lefagyasztott AK2 felengedne. Ezt követően az egészet liofilezzük. A laboratóriumi gyakorlat szempontjaira tekintettel az AK2 -t és a normálszérumot - az optimális koncentrációviszony megtartása mellett - úgy adagoljuk, hogy minden egyes ampulla 100 próbacsövecskéhez elegendő mennyiségű IIPR-t tartalmazzon. Az IIPR alkalmazása előtt a liofilizátumot, amit egy ampulla tartalmaz, 10 ml tesztpufferben feloldjuk, s szobahőmérsékleten történő 1 órás előinkubáció után lOOjul IIPR-t a próbacsövecskékbe egyenként be pipettázunk. Miután a ligandumspecifikus ellenszérumokat majd nem kizárólag tengeri malacok (GP) illetve nyulak (Rab) immunizálásával nyeik, mindössze e két fajta IIPR (GP-IIPR és Rab-IIPR) előállítása elegendő az említett immunmeghatározásoknál a kötött (B) és a szabad (F) ligandum szétválasztására. Ezáltal a B/F-elválasztás standardizálása a találmányban ismertetett módszer alapján a próbák kivitelezéséhez szükséges eszköz-összeállítások előállítását nagymértékben hatékonynyá teszi. Mindehhez társul a RIA, EIA és más 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
