191984. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hibridómák és ezek segítségével antitestek előállítására
15 191984 16 sejtvonal-klónt nyerünk, amely szülő-sejtvonalként szolgál hibridóma-készitményhez. 7. Példa. Humán nyelvrák-sejtekből egy szülő-sejtvonal készítése hibridóma-készítményhez. A-549 humán nyelvrák-sejteket tenyésztünk 24 órán át RPMI 1640 tápközegben. A tenyészethez EMS mutációs induktort adunk, 1 mmól/liter végső koncentrációban. Három órás inkubáció során mutáció indukálódik az A-549 humán nyelvrák sejtekben. A sejteket ez után háromszor mossuk szérum-mentes RPMI 1640 tápközegben, majd tenyésztjük 48-72 órán át teljes RPMI 1640 tápközegben, ezután pedig 3-4 héten át tenyésztjük 2,0 pg/ml BudR-t tartalmazó RPMI 1640 tápközegben. Mintegy három hét múlva gyors növekedés következik be a sejtek számában, és a tapadó sejtek egységes kiónjai képződnek. A tenyészetet további két hétig inkubáljuk RPMI 1640 tápközegben, amely 10 mg/ /ml BudR-t tartalmaz. A növekvő sejteket, mint BudR rezisztens törzseket, kiválasztjuk. Ezeket a sejteket ezt követően HAT-szelekcióra történő érzékenységre ellenőrizzük, mint ahogyan ezt az 1. példában tettük. Ennek eredményeképpen 5 TK-hiányos sejtvonal-klónt, amelyek szülő-sejtvonalak hibridóma készítményhez, nyerhetünk humán nyelvrák sejtekből. Ezeket a kiónokat SUN N-33-1 - SUN N-33-5 jelöléssel azonosítjuk. Az 1-7. példákban létrehozott szülö-sejtvonalakat lehet fuzionálni B-sejtekkel, mint pl. lépsejtekkel, hibridómák képzése érdekében, amely hibridómák immunglobulinokat hoznak létre a tenyészetben, amint ezt a következő példa szemlélteti. 8. Példa Hibridóma előállítása az 1. példa szerinti ME 1 fúziójával A-549 humán nyelvrák sejtekkel immunizált egér lépsejtekkel, és a hibridómából nyert monoklonális antitest kiválasztásának bizonyítása. 107 sejt SUN N-21-2 (szülő-sejtek) tenyészetét egyesítjük 4 hetes BALB/C nőivarú egér 5.107 lépsejtjével (partner-sejtek), amely egereket négy héten át egyszer egy héten beoltottunk A-549 humán nyelvrák sejtekkel, alkalmanként 107 sejtet tartalmazó dózissal. Fúziós közvetítőként polietilén-glikolt (PEG 1000, a Wako Pure Chemical Industries Ltd. gyártmánya) használunk 40% koncentrációban. A fúziós eljárás a következő: A szülő-sejteket és a partner-sejteket összekeverjük és centrifugáljuk egy centrifuga-csőben és a felülúszót eldobjuk. Mintegy 0,5 ml PEG 1000-t, amelyet 40%-ra hígítottunk RPMI 1640-el, adunk a beburkolt sejtekhez. A keveréket állni hagyjuk 3 percen át és 500 fordulat/perccel centrifugáljuk 3 percen át. Ezután 5 ml tápközeget adunk lassan hozzá, és a keveréket centrifugáljuk, és a felülúszót elöntjük. Az összes sejtet lassan átvesszük egy T-75 lombikba (Falcon 3024) és tcvábbi tápközeget adunk hozzá, amíg a teljes térfogat kb. 40 ml lesz. Egy éjszakán át történő tenyésztést követően az összes sejtet magába foglaló tenyészetet egy centrifuga-csőbe visszük át, centrifugálunk, majd a felülúszót elöntjük. HAT tápközeget (40 ml) adunk a beburkolt sejtekhez és alaposan átkeverjük. A keveréket egy mikrolemez 96 ürege között elosztjuk, kb. 100 /ul mennyiséget adva egy üregbe. Ugyanezt a folyamatot megismételjük 4 mikrolemez üregeit megtöltve sejt és HAT tápközeg keverékével. Egy hetes inkubálást követően az üregek kb. 10%-ában telepek képződnek. Ezeknek a telepeknek az a jellegzetessége, hogy sokkal laposabban terjednek szét, mint a szülő-sejtek telepei. Az inkubálás első hetétől kezdve egy csepp (kb. 25-30 pl) HT tápközeget (amely azonos a HAT tápközeggel azzal a kivétellel, hogy nem tartalmaz aminopterint) adunk minden egyes üreghez. Amikor hibridóma elfogadható növekedése megtörtént (kb. 10-14 nap múlva), a tenyészet felülúszóját ellenőrizzük az A-549 humán nyelvrák elleni monoklonális antitest megjelenésére az A-fehérje-kötés SRBC módszerrel. A képződött 45 klón közül négyet találunk A-549 elleni monoklonális antitestet képzőnek. A négy klón egyikét az 1. példában leírtak szerint szubklónozzuk. Négy szubklón nő ki és ezek mind termelnek monoklonális antitestet A 549 ellen. Ezeket a hibridóma sejteket ismert módon tároljuk, pl. 10% FCS-t, 10% DMSO-t és 80% szokásos tápközeget tartalmazó tápközegben szuszpendálva és folyékony nitrogénben vagy kb. -80 °C hőmérsékleten fagyasztóban tároljuk. I. Kísérlet A 8. példa szerint előállított hibridóma által termelt immunglobulinok osztályának és alosztályának meghatározása Ouchterlony módszerrel. 5 ml 15%-os agaróz oldatot (0,01% NaN3- -al; helyezünk négy Petri-csészébe (belső átmérő: 52 mm) és 30 percig állni hagyjuk, amíg az agaróz megszilárdul. Üregeket lyukasztunk az agaróz gélbe minden egyes csészében, amint ezt az 1. ábra bemutatja. A perem melletti üregekbe az 1. Táblázatban felsorolt antitestek mindegyikéből 5 pl-t adunk, míg a központi üregek az agaróz gélben a 8. példában készített hibridóma által termelt négy monoklonális antitestet (LAC 1, 2, 5 és 4) tartalmazó tápközeg tízszeres kon-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
