191984. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hibridómák és ezek segítségével antitestek előállítására
17 191384 18 centrátumából 15 jul-el vannak töltve. A géleket 24 őrén át állni hagyjuk, és minden egyes monoklonális antitest osztályát a precipitációs vonal képződésével meghatározzuk. 1. Táblázat Szám Antitest Eredet 1 anti-humàn lg M (Hoechst AG) Nyúl 2 anti-humán Ig G (Hoechst AG) Nyúl 3 anti-egér Ig G (Capel Co.) Nyúl 4 anti-egér Ig M (Hoechst AG) Birka 5 anti-humán IG (G+A+M) (Hoechst AG) Birka 6 anti-humán Ig A (Hoechst AG) Nyúl A négy vizsgált antitestet egér lg G-nek találjuk, mivel az összes precipitációs vonal a 3 üreg és a 7 központi üreg között alakul ki. Az Ig G alosztályát azonos módszerrel határozzuk meg. Amint a 2. ábra bemutatja, öt üreget lyukasztunk az agaróz gélbe a négy Perti csésze mindegyikében. A négy perem melletti üregbe a 2. Táblázatban felsorolt alosztályok antitestjeiből 5 pl-eket helyezünk be, míg a központi üregek az agaróz gélben a monoklonális antitestek (LAC 1-4) mindegyikéből 15 jul-el vannak töltve. A Petri-csészéket 24 órán át állni hagyjuk szobahőmérsékleten. 2. Táblázat Szám Antitest Eredet 1 anti-egér Ig G 1 (Miles Laboratories Inc.) Nyúl 2 anti-egér Ig G 2a (Miles Laboratories Inc.) Nyúl 3 anti-egér Ig G 2b (Miles Laboratories Inc.) Nyúl 4 anti-egér Ig G 3 (Miles Laboratories Inc.) Nyúl A vizsgált négy monoklonális antitestet lg 2a-nak találjuk, mivel precipitációs vonalai a 2. és 5. üregek között keletkeznek. A 8. példa szerinti hibridóma által termelt monoklonális antitestek mennyisége kb. 30 /ug/ml, amely csaknem azonos az egér mielóma sejt, mint szülő-sejt felhasználásával készült hibridómák által termelt monoklonális antitestek mennyiségével. A 8. példa szerinti hibridóma által termelt antitest egységességét tovább bizonyítjuk gél-elektroforézissel. A fenti eredmények azt mutatják, hogy a jelen találmány szerinti sejtvonalak (pl. az ME 1 sorozat SUN N-21-1 sejtvonala), amikor B sejtekkel fuzionáljuk, olyan immunglobulinokat állítanak elő, amelyek a B-sejtből adott genetikai információt fejezik ki. A humán mielóma sejtek, amelyeket megkíséreltek szülő sejtekként használni hibridóma készítéséhez, számtalan különböző defektussal bírnak, mint pl. nehézségeket a tenyésztésben, kis növekedési sebesség, és instabilitás. Amint az alábbiakban bemutatjuk, a jelen találmány szerinti sejtvonal viszont képes következetes növekedésre, amely a ráksejtek öröklött tulajdonsága. 2. Kísérlet A jelen találmány szerinti ME 1 sejtvonal és a ráksejtek növekedési profiljai. 10 ml, 2.105 Colo 38 humán melanoma sejt/ml koncentrációjú sejttömeget inkubálunk 10% FCS-et is tartalmazó RPMI 1640 tápkőzegben. A Colo 38-ból származó ME 1- -sorozat SUN N-21-1 törzséből 2.105 sejt/ml-t tartalmazó 10 ml tenyészetet szintén inkubálunk 10% FCS-et is tartalmazó RPMI 1640 tápközegben. Egy másik, azonos mennyiségű SUN N-21-1 sejtet tartalmazó 10 ml-es tenyészetet inkubálunk olyan, 10% FCS-t is tartalmazó RPMI 1640 tápközegben, amely 8-azaguanint is tartalmaz 20 pg/ml végső koncentrációban. Mintákat veszünk és az élő sejtek számát minden egyes tenyészetben megszámoljuk. Az eredményeket a 3. ábrában mutatjuk be, amelyből az tűnik ki, hogy a SUN N-21-1 növekedése hasonló a Colo 38 humán melanoma sejt növekedéséhez és ezek a tapasztalatok csak kissé változnak még 8-azaguanin jelenlétében is. A 8. példában készített hibridóma négy kiónja szintén a SUN N-21-1 növekedési profiljához hasonló növekedési profillal bír, bár ezt a 3. ábra nem mutatja be. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás fajlagos fehérjéket termelő hibridómák előállítására, azzal jellemezve, hogy állati (embert is beleértve) eredetű B sejteket humán melanoma sejtek, humán hepatoma sejtek vagy humán tüdó-karcinoma sejtek természetes vagy indukált mutációjával előállított sejtjeivel fuzionáltatunk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy antigénnel immunizált, állati (embert is beleértve) eredetű B sejteket használunk. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy humán melanoma sejtként. Colo 38 vagy M21 sejteket használunk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 10
