191984. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hibridómák és ezek segítségével antitestek előállítására
13 191984 14 50 pg/ml. Azokat a sejteket, amelyek ilyen körülmények között normális növekedésre képesek, kiválasztjuk, mint 8-azaguanin-rezisztens sejteket. Ezeket a sejteket ezt követően az 1. példában leírt módszer szerint HAT szelekciónak vetjük alá, és hat El-sejtvonalat nyerünk. Az 1-3. példákban összesen 17 ME 1 sejtvonalat nyerünk rosszindulatú humán melanóma sejtekből (Colo 38-ból) három különböző módszerrel. A sejtvonalakat SUN N-21-1 - SUN N-21-17 jelzéssel azonosítjuk. 4. Példa M21 humán tumor-sejtből egy szülö-sejtvonal készítése hibridóma-készítményhez Ez a példa azt mutatja meg, hogy lehet készíteni hibridómakészítményhez szolgáló szülő-sejtvonalat más humán tumor sejtekből, nemcsak Colo 38-ból. A 4. példában alkalmazott módszer lényegében azonos az 1. példában leírt módszerrel. M21 humán melanóma sejteket 60 órán át tenyésztjük, amíg elérik a log fázist. MNNG mutációs induktort adunk a sejtekhez 5 pg/ /ml végső koncentrációban. 36 órás inkubálás után, amely közben a melanóma-sejtek 35%-át elpusztultnak találjuk, a tenyészetet megszabadítjuk az MNNG-től szérum-mentes RPMI 1640-es történő mosással három centrifugálás közben. 2.105 élő sejt/ml koncentrációban összesen 10 ml-t inkubálunk egy 8-azaguanint 20 Mg/ml végső koncentrációban tartalmazó tápközegben. Egy héten belül a sejtek legalább 99,5%-a elpusztul, de az inkubációt folytatjuk további két hétig hasonló körülmények között. A tenyészetet egyszer egy nap ellenőrizzük bármiféle sejtnövekedésre mikroszkóp alatt. 20 nappal később a sejtek számában fokozatos növekedés következik be, és további 5 napon belül gyors sejtnövekedés megy végbe. A kinőtt sejtekét centrifugálással kigyűjtjük és 2.105 sejt/ml koncentrációban 10 ml tápközegben szuszpendáljuk, a tápközeg végső koncentrációban 50 pg/ml 8- -azaguanint tartalmaz. Az inkubációt további két hétig folytatjuk, és azokat a sejteket, amelyeknek száma növekedik, kiválasztjuk, mint 8-azaguanin rezisztens sejteket. Ezeket a sejteket HAT-szelekciónak és ismételt szubklónozásnak vetjük alá az 1. példa szerinti módon. Ennek eredményeképpen hat szülő sejtvonalat nyerünk M21 humán melanóma-sejtből hibrídóma-készit.ményhez, amelyek 8-azaguaninra rezisztensek és amelyek HAT-tápközegben elpusztulnak. Ezt a hat sejtvonalat a ME-2 sorozatban SUN-N-22- -1 - SUN N-22-6 jelöléssel azonosítjuk. 5. Példa Humán liepatóina sejt bői egy szülő-sejt -vonal készítése biliridóma-készítmény hex. (I) módszer) IIC C-4 humán hepatóma sejtet tenyésztünk RPMI 1640-ben 24 órán át. A tenyészethez EMS (etil-metánszulfonát), Sigma Chemical Co. gyártmánya) mutációs induktort adunk, hogy annak végső koncentrációja 1 mmól/liter legyen. A 3 órás inkubálás folyamán mutáció indukálódik a HC C-4 humán hepatóma sejtben. A sejteket azután háromszor mossuk szérum-mentes RPMI 1640 tápközeggel, 48-72 órás időtartamon át tenyésztjük teljeB (szérumot is tartalmazó) RPMI 1640 tápközegben, majd a továbbiakban 3-4 hétig tenyésztjük olyan RPMI 1640 tápközegben, amely 2,0 pg/ml 8-azaguanint tartalmaz. Mintegy három hét múlva gyors növekedés következik be a Bejtek számában, és tapadó sejtek egységes kiónjai képződnek. A tenyészetet további két hétig inkubáljuk RPMI 1640 tápközegben, amely 10 pg/ml 8- -azaguanint tartalmaz. A növekvő sejteket, mint 8-azaguanin rezisztens törzseket, kiválasztjuk. Ezeket a sejteket ezt követően HAT-szelekcióra történő érzékenységre ellenőrizzük, mint ahogyan ezt az 1. példában tettük. Ennek eredményeképpen 8-HGPRT-hiányos sejtvonal kiónt, amelyek szülö-sejtvonalak hibridóma-készíUnényhez, nyerhetünk humán hepatóma sejtekből. Ezeket a klónokat SUN-N-31-1 - SUN N-31-8 jelöléssel azonosítjuk. (I. Példa Humán hepatóma sejtből egy szülö-sejtvonal készítése hibridóma készítményhez (E módszer) Az 5. példában leírtakkal azonos módon HC C-4 humán hepatóma sejtek tenyészetét EMS mutációs induktorrul kezeljük. A tenyészetet azután az EMS-tól megszabadítjuk szérum-mentes RPMI 1640 tápközeggel történő mosással. A tenyészetet 3-4 héten át inkubáljuk egy 2,0 g/ml BudR-t (bróm-deoxi-uridin, a Sigma Chemical Co. gyártmánya) tartalmazó tápközegben. A növekvő sejLeket olyan tápközegbe visszük át, amely 10 g/ml BudR-L tartalmaz, ebben a tápközegben mintegy 2 héten át inkubálunk. A sejteket, amelyek növekedést érnek el ebben az inkubációban, kiválasztjuk, mint Budit-rezisztens törzsöket. Ezeket azután ellenőrizzük HAT szelekcióra történő érzékenységre, az 1. példában leírtak szerint. Ennek eredményeképpen a humán hepatóma sejtekből hat TK hiányos 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 50 65 8
