191984. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hibridómák és ezek segítségével antitestek előállítására
H 191984 12 rom centrifugálás közben. Összesen 10 ml ilyen módon kezelt sejtet (2.105 sejt/ml) adunk egy, a végső koncentrációban 1- -50 /ug/ml 8-azaguanint tartalmazó tápközeghez. A tenyésztést folytatjuk legalább egy hétig megfelelő 8-azaguanin koncentráció mellett, amely biztosítja, hogy a sejtek legalább 99%-a elpusztul egy héten belül 20 /ug/ml 8-azaguaninban. Ennél a 8-azaguanin koncentrációnál a tenyésztést folytatjuk legalább két hétig a kezdettől számitva, a sejtnövekedést naponta figyelve. Mintegy két hét múlva a sejt gyors növekedése következik be. Ekkor a sejteket centrifugálással összegyűjtjük és egy olyan tápközeghez adjuk, amely 50 jug/ml végső koncentrációban 8-azaguanint tartalmaz (a beadott sejtek száma azonos azzal, amelyet az első 8-azaguaninos kezdésnél alkalmaztunk: 2.105 sejt/ml). Azokat a sejteket, amelyek a 2 hetes inkubációt túlélték, kiválasztjuk, mint 8-azaguanin rezisztens törzseket. A 8-azaguanín rezisztens törzsek sejtjeit szérum-mentes tápkőzegben mossuk háromszori centrifugálással és átvisszük 10 ml HAT tápközegbe. A tápkőzeg RPMI 1640 tápközegből áll, amely ki van egészítve 10% PCS-el (CSL Co., Ausztrália, terméke), amelyhez hipoxantint, aminopterint ób timidint adunk 10*4 mól/liter illetve 4.10-7 mól/liter és 1,6.10“* mól/liter végső koncentrációban. A sejtek koncentrációja a HAT tápközegben 10* Bejt/ml. Az inkubáció 5. napján a sejteket túlélésre ellenőrizzük, triptán kékkel megfestve azokat. Ha az összes sejtet elpusztultnak találjuk a HAT tápközegben, a 8- -azaguanin rezisztens sejtek egy másik részletét elhelyezzük 96 üregben 0,1 sejt/üreg valószínűséggel lép-sejtekkel együtt, amelyeket minden egyes üregben elhelyeztünk, mint betápláló réteget 105 sejt/üreg koncentrációval. Körülbelül egy hetes inkubáció után hat klón képződik a 96 üreg közül. Az inkubálást további egy vagy két hétig folytatva a sejtek száma minden egyes kiónban kb. 105/ml-re növekszik. Ez után az összes kiónt HAT szelekciónak vetjük alá. A sejtek minden egyes kiónban elpusztulnak 5 napon belül. A hat klón egyikét ismét lemezre helyezzük, 96 üregbe, az előzőhöz hasonló módon, és szubklónozzuk, 8 kiónt nyerve. Ezeket is számban növekedni hagyjuk és HAT szelekciónak vetjük alá, bizonyítandó, hogy az öszszes sejt elpusztul a HAT tápközegben. Az így nyert rosszindulatú humán melanoma sejteket, amelyek rezisztensek 8-azaguaninra és érzékenyek HAT szelekcióra, ME 1- -sorozatnak nevezzük. Ezek a következő öszszetételű tápközegben vannak tárolva: [10% FCS, 10% DMSO (dimetil-szulfoxid) és 80% közönséges tápközeg), folyékony nitrogénben vagy egy fagyasztón belül kb. -80 °C hőmérsékleten. 2. példa Colo 38 humán tumorsejtból egy szülő sejtvonal készítése hibridóma-készítményhez (B módszer) A B módszer abban különbözik az A módszertől, hogy a mutációt UV besugárzással indukáljuk kémiai induktorok helyett. A rosszindulatú humán melanoma sejteket log fázisban egy 10 cm átmérőjű Petri-csészébe helyezzük 2.105 sejt/ml koncentrációban (összesen 10 ml-t). UV-lámpával (GL 15, a Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. gyártmánya) történő besugárzás után (30 cm magasságból), 8-azaguanint adunk a sejtekhez, hogy annak végső koncentrációja 20 pg/ /ml legyen. Egy héten belül a sejtek legalább 99,5%-a elpusztul. Az inkubációt folytatjuk további két hétig hasonló körülmények között, naponta figyelve a tenyészetet. Három héttel az első 8-azaguanin-beadás után a sejtek száma gyorsan nő, a sejtek egységes szuszpenzióját képezve. Ezeket centrifugálással összegyűjtjük és 2.105 sejt/ml koncentrációban olyan tápközeghez adjuk, amely végső koncentrációban 50 /ug/ral 8-azaguanint tartalmaz. A sejteket amelyek túlélik a további két hetes inkubálást, kiválasztjuk mint 8-azaguaninrezisztens sejteket. Ezeket a sejteket ezt követően az 1. példában leírt módszer szerint HAT szelekciónak vetjük alá, és három ME 1 sejtvonalat nyerünk. A 8-azaguanin-rezisztens sejtek megjelenésének valószínűsége az 1. példában elért érték mintegy egyötöde. Annak valószínűsége azonban, hogy a 8-azaguanin-rezisztens sejtek érzékenyek a HAT szelekcióra, azonos mindkét példa szerinti módszernél. 3. Példa Colo 38 humán tumorsejtből egy szülő-sejtvonal készítése hibridóma-készítményhez (C módszer) A C módszer abban különbözik az A és a B módszertől, hogy a 8-azaguanint közvetlenül a humán tumor-sejt tápközegéhez adjuk. 10 ml, Colo 38 rosszindulatú humán melanoma sejtet 2.105/ml koncentrációban log fázisban tartalmazó tenyészetet 5 napig inku bálunk 5 /ug/ml koncentrációjú 8-azaguanin jelenlétében. A 8-azaguanin mennyiségét ez után 20 jug/ml-re növeljük. Az inkubációt folytatjuk, 10 napon belül csaknem minden sejt elpusztul. Az inkubációt azonban tovább folytatjuk további 20 napig azonos körülmények között. A sejtnövekedés elérésének valószínűsége kicsi, de a sejtek számában gyors növekedés következik be a vizsgált 18 lombik egyikében. A kinőtt sejtek egy részét további két hétig tenyésztjük 8-azaguanin jelenlétében, amelynek végső koncentrációja 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
