191984. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hibridómák és ezek segítségével antitestek előállítására
9 191984 10 sa vérható tőle, amelyek humán fehérjék és ezért be lehet vezetni azokat emberekbe anélkül, hogy nem kívánt antigenicitás problémáját okozná. Még fontosabb, hogy a jelen találmányról úgy véljük, hogy képes hibridómákat létrehozni nemcsak humán B sejtekkel, hanem humán T sejtekkel is. Így a találmány szerinti szülő sejtvonalat fuzionálni lehet egy partnerral, amely gamma interferon vagy limfokin termelésére képes humán T sejt. Az ennek eredményeképpen létrejött T sejt hibridómától azt várjuk, hogy rendelkezik gamma-interferon és limfokin termelő képességgel. Ennél fogva a jelen találmány szerinti sejtvonalak az alkalmazás széles választékát találják és ezeket fel lehet használni különböző típusú hibridómák előállításához. Egy hibridóma előállító folyamatot, amelyben szülő sejtvonalként a létrehozott sejtvonalat használjuk, a következőkben mutatjuk be. A használandó tápközeg a szokásos tápközegek bármelyike lehet, mint pl. Eagle MEM, Dulbecco által javított MEM és RPMI 1640, amely 10% CS-t (borjú-szérum), 5% FCS-t + 5% CS-t vagy 10% FCS-t tartalmaz. A szülő sejtek szokásos fenntartásához ezeknek a tápközegeknek bármelyike használható, de a hibridóma-készítés speciális céljaira 10% FCS előnyös. Az első lépésben a szülő sejtek, azaz a humán ráksejtek és a partner sejtek, azaz lépsejtek fuzionálnak 1:5 arányban HVJ-vel (hemagglutináló virus Japánból, Sendai-vírusként is ismeretes) vagy polietilén-glikollal (PEG), mint közvetítővel. PEG 1000 30-50%-os oldata az előnyös. A fuzionált sejteket HAT szelekciónak vetik alá a korábban már leírt eljárás szerint. Az ennek eredményeként kapott hibridóma sejtek átrostálását főként a tenyészet felülúszójának ellenőrzésével hajthatjuk végre, az immunglobulinok megjelenésére, az immunglobulinokat előállító hibridóma kiónokat az SPA-vak-SRBC módszerrel (SPA: Staphylococcus aureus .A' fehérje; lásd: Procedures of Immunological Experiments (Az immunológiai kísérletek eljárásai) VII., 2375 oldal/vagy ELISA-módszerrel (Dynatech-módszer) .keresve meg. A kiónokat ezután fokozatosan szaporodni hagyjuk a sejt-populációban és amikor elérik 105 sejt/ml koncentrációt, szubklónozásnak vetjük alá. Abból a célból, hogy biztosítsuk, hogy az összes hibridóma-sejt monoklonális legyen, lemezre kell vinni ezeket, egy 96 üreges mikro-lemezre, amelynek minden egyes üregébe kb. 105 normál lépsejtet helyeztünk el, mint betápláló réteget. A hibridóma sejteket olyan koncentrációra kell hígítani, hogy biztos legyen, hogy egynél több hibridóma sejt nem kerül az egyes üregekbe (0,1 sejt/üreg átlagszám a valószínűség alapján). Mintegy egy hetes inkubálás után az Így létrejött kiónokat ellenőrizzük fajlagos antitestet előállító képességük alapján. A fenti eljárást addig ismételjük, amíg monoklonális hibridóma sejteket nyerünk. A hibridóma által előállított immunglobulinokat könnyű ellenőrizni osztályuk és alosztályuk szei'ínt az agaróz-gélt alkalmazó Ouchterlony technikával. Olyan immunglobulinok, amelynek termelését várjuk híbridómától, elleni antitesteket reagáltatunk a tenyészet felülúszójával agaróz lemezen és a 24 órával később feltűnő precipitációs vonalakat megfigyeljük. Az Ouchterlony módszer részleteivel kapcsolatban lásd az 1. kísérletet. Amint az előbbi leírásból nyilvánvaló, a jelen találmány tagadja Milsteinnek és munkatársainak azt a következtetését, hogy a hibridóma készítéséhez a szülő sejtvonalaknak olyan tumor sejteknek kell lenniök, amelyek csontvelő sejtekből erednek, mint pl. mielóma vagy B sejtek. Más szavakkal a jelen találmány feltalálói azt demonstrálják, hogy bármilyen tumor-sejt, amely in vitro képes nőni, használható hibridóma készítéshez alkalmas szülő-sejtek létrehozásához. A jelen találmány szerint létrehozott humán tumor sejtvonalat sokkal egyszerűbb tenyészteni, mint a hagyományos mielóma sejtvonalat, és még stabilabb is, valamint burjánzóképesebb is, mint az utóbbi. Ezt a sejtvonalat használva Bzülő sejtvonalként, humán-egér hibridómát lehet előállítani a jelen találmány szerint. A jelen találmány szerint nem csupán egy monoklonális antitestet termelő hibridómát, hanem olvan hibridómákat is elő lehet állítani, amelyek hasznos fiziológiai aktivitással rendelkező limfokinokat termelnek. A jelen találmány szerinti hibridóma előállításához alkalmas szülő sejtvonal készítésének módszerét, az említett sejtvonalból egy hibridóma készítésének folyamatát, valamint a képződött hibridómából eredő antitest termeléséhez szükséges folyamatot és az antitest azonosításának módszerét az alábbiakban kiviteli példákkal és kísérleti adatokkal írjuk le. 1, Példa Colo 38 humán tumor sejtből egy szülő sejtvonal készítése hibridóma-készítményhez (A módszer) A következő kiviteli példákban minden tenyésztést 5% C02+95% levegő atmoszférában hajtottunk végre kb. 100% relatív nedvességtartalomnál (r. n) és 37 °C hőmérsékleten. Colo 38 rosszindulatú humán melanoma sejtet 2 vagy 3 napig tenyésztjük, amíg az eléri a log-fázist. A sejtekhez MNNG (N-metil-N’-nitro-N-nitrozo-guanidin, Sigma Chemical Co. gyártmánya) mutációs induktort adunk, hogy végső koncentrációja 0,05-10 ug/ml legyen. 36 órás inkubálás után 5 pg/ml MNNG koncentrációnál a melanoma sejtek mintegy 20%-a pusztul el. A tenyészetet az MNNG-től megszabadítjuk szérum-mentes RPMI 1640-el (a Nissui Seigaku Co., Ltd. gyártmánya) há5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
