191957. lajstromszámú szabadalom • Eljárás egypetéjű ikrek előállítására embrió darabolással
2 191957 3 A találmány tárgya eljárás egypetéjű ikrek előállítására embrió-darabolással, elsősorban állattenyésztésben. A mikroszkopikus méretű (70-140 /um) korai juh-, szarvasmarha-, ló-, és egérmorulák mechanikus darabolását már többen elvégezték (Willadsen, 1979, Willadsen és Polge 1981, Ozil és munkatársai 1982, Lambert és munkatársai 1983, Moustafa és Hahn 1978. és mások). Willadsen és Godke (1984.) juh- és szarvasmarha blastocysták darabolását is megoldották. Az idézettek által beültetett (átültetett, vagy visszaültetett) darabolt embriókból több esetben egypetéjű ikrek születtek. Az egypetéjű ikrek egyrészt nagyobb szaporaságot jelentenek, másrészt rendkívül értékes kísérleti egyedek, hiszen az egyik genetikailag azonos példány kontrollként szolgálhat (pl. takarmányozási kísérletek). Foote (1983.) szerint az embriók darabolása várhatóan 1990 körül válik rutinjellegűvé a szarvasmarha embrió-átültetésben. Érdemes megemlíteni azt az esetet (Massip és munkatársai 1983.), mikor egy szarvasmarha-blastocysta spontán kettéválását figyelték meg in vitro. Az embrió burkán (zona pellucida) apró lyuk keletkezett, melyen át az embrió fele fokozatosan kitüremkedett (diaboló-alak) úgy, hogy az embrió-csomó és a trophoblast egyaránt egyenlően oszlott meg az iker-blastocystákban. Az embrió mechanikus felezése rendkívül eszköz-, munka éB időigényes. Az erre a célra alkalmas mikromanipulátorok drágák és a mikroeszközök (kések, pipetták, kampók) elkészítéséhez ugyancsak drága berendezés szükséges. Minden egyes embrióhoz cserélni kell a steril eszközöket és az egész műveletet steril boxokban célszerű végezni. A megfelelő átültethetőség érdekében az embriódarabokat be kell csomagolni; erre a célra rossz minőségű vagy más fajú (pl. sertés-) embriók zóna pellucidáit használják. A mechanikus embrióvágási módszer, minthogy kis hatásfokú, drága eszközök szükségesek hozzá, továbbá nagy jártasságot igényel, eddig nem terjedt el az állattenyésztési gyakorlatban. Az idézett munkák bizonyítják, hogy a morulék minden sejtje és - juh- és szarvasmarha esetében igazoltan, más fajoknál feltehetően - a blastocysták embriócsomójának sejtjei omnipotensek, vagyis akár egyetlen sejtjükből is egészséges egyed születhet. Dániel és Takahashi (1965) lézer mikrosugárral pusztították el korai nyúl embriók sejtjeit, úgy, hogy egy embrióban csak egyetlen sejt maradt életben, mely a kezelés után tovább osztódott. Az az eljárás, amikor embrióátültetés segítségével a recipiens saját embriója mellé tesznek be még egyet, vagy egy recipiensbe két (több) embriót ültetnek be, az esetek 50%-ában vegyes ivarú ikreket eredményez. Hasonló a helyzet az ikerellésre történő (kevéssé hatékony) szelekció és a hormonkezeléssel kiváltott bizonytalan hatású .korlátozott szuperovuláció' esetében. Szarvasmarhában az ilyen ikerpárok 94%-ában (más fajoknál ritkábban) a magzatburkok ezrei egyesülnek és az átjutó és megtelepedő hímnemű sejtek és hormonok hatására az üsző meddő lesz. (Freemartin-szindróma; Marcim 1974, Foote 1963.). A Freemartin-üszók kiegyensúlyozatlan, ideges természetű állatok, melyek hizlalásra is csak kevésbé alkalmasak és társaikat is zavarják (Hámori, 1974.). Célunk a találmánnyal az eddig ismert megoldásoknál egyszerűbb, gyorsabb, a tenyészhelyeken is alkalmazható eljárás kidolgozása egypetéjű ikrek előállítására. A ta álmány szerint a korai embrió felületére lézersugarat fókuszálunk és a lézersugárral az embrióban lévő sejtek egy részét elpusztítjuk és/vagy az embrió zóna pellucidáját legalább részlegesen felnyitjuk. A találmány lényege: a fókuszált lézerfény tern ikus vagy más (például fotodinamikus) hatásával az embrió egyes sejtjei elpusztíthatok úgy, hogy az embrió kettő (vagy több) darabra váljon, mely darabok elegendő számú omnipotens élő, osztódóképes sejtet tartalmaznak. Az eljárás végrehajtásánál előnyösen felső megvilágítású fluoreszcens mikroszkópot használunk, amelybe a fluoreszcens gerjesztő fénysugár útvonalán (esetleg fotomikroszkópba a fototubuson át vagy sztereo mikroszkóp esetén prizmával vagy tükörrel bevetitve a két optikai rendszer között) lézerfényt vezetünk. A lézernyaláb keresztmetszeti intenzitás-eloszlása megfelelő optikai rendszer alkalmazásával a tárgysíkban körszimmetrikus vagy keskeny vonal alakú folttá alakítható ki. A fénynyaláb a tárgy (embrió) síkjára fókuszált. A fókuszált folt tipikus mérete körszimmetrikus folt esetén 1-10 /um átmérőjű, vonal alakú folt esetén a szélesség 5-10 /um hosszúság 10-50 /um. A vonal alakú leképzéssel egyenértékű eredményt ad egy olyan megoldás, ahol a kör alakú foltot egy egyenes menten mozgatjuk, alkalmas térbeli fényeltérítő rendszer pl. rezgő v. forgó tükör vagy akusztooptikai deflektor felhasználásával. A fé íyforrás lehet akár folytonos, akár impulzus Üzemű lézer. Folytonos lézerre példa az argon lézer (1-2% teljesítménnyel az 515 nm vagy 488 nm hullámhosszakon), impulzus lézerre a rubinlézer (694 nm), a Nd-YAG vagy Nd-üveglézer (1,06 /um) illetve ezek frekvencia-kétszerezett változata (530 nm), 1-100 mJ impulzusenergiával, előnyösen Q-kapcsolt üzemben, 10-20 nsec impulzusléz€r, pl. KrF (248 nm) hasonló energiával ill. impulzusidővel. Folytonos lézer esetén az optikai rendszerbe rae gfelelö optikai zár kerül. Az embrióvágáshoz rövid idejű, előnyösen 1 ms ill. annál röv debb idejű fényimpulzusokat hasz5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
