191957. lajstromszámú szabadalom • Eljárás egypetéjű ikrek előállítására embrió darabolással
4 191957 5 nálunk. Ilyen rövid időtartamok alatt a hővezetés nem számottevő és a vágási vonal környezetében lévő sejtek csak kevéssé károsodnak. Impulzuslézernél külön zárra értelemszerűen nincs szükség. Látható, ill. infravörös színképtartományban az embriók gyakorlatilag átlátszók. A megfelelő hatás elérésére ezért az embriót meg kell festeni. Ultraibolya lézer esetén a festés elmaradhat, mert a 250 nm körüli tartományban a sejtek jól abszorbeálnak. Az alkalmazott festéknek vitálisnak kell lennie (nem szabad megölnie, vagy osztódásukban jelentős mértékben gátolnia a sejteket) és jó hatásfokú elnyelést kell biztosítania. Ar-lézer esetében a neutrálvörös, az akridin-organe és a kinakrin lehet alkalmas festőanyag. A talámányt a továbbiakban példák és rajzok alapján részletesebben ismertetjük. A rajzokon az 1. ábra egy szedercsira átvágása, a 2. ábra egy hólyagcsira darabolása, a 3. ábra egy mintatartó, a 4. ábra folytonos lézert és fluoreszcencia mikroszkópot tartalmazó elrendezés, és az 5. ábra impulzuslézert és közönséges mikroszkópot tartalmazó elrendezés. Szedercsíra állapotú korai (8-32 sejtes) embrióknál a teljes keresztmetszetet átvágjuk, a zóna pellucida részleges vagy teljes átvágását is beleértve. Ezt az esetet szemlélteti az 1. ábra, amelyen feltüntettük az 1 zóna pellucidát, az osztódó 2 sejteket és a lézérsugaras vágás 3 nyomvonalát. Késői blastocysták esetében viszont elegendő az embriócsomó átvágása egy jóval rövidebb (20 /um-nél kisebb) vágással; Így a zóna pellucida csak kismértékben károsodik. Ezt mutatja a 2. ábra, amelyen az 1 zóna pellucidát, az osztódó 2 sejteket, a lézersugaras vágás 3 nyomvonalét és a 4 trophoblastot jelöltük. A daraboláshoz szükséges impulzusenergia-sűrűség az embrió felületén (1 ms impulzusok esetén) kb. 10 pj/pm2. A lézeres embrióosztást célszerűen olyan szignálható szögletes kapilláris csőben végezzük, melyben az embrió tápfolyadékban eltartható, mélyhűthető és felolvasztható, és melyből megfelelő eszközzel (véres ill. vértelen úton) közvetlenül a recipiens méhébe juttatható. A szögletes kapilláris anyaga megfelelő minőségű üveg (kvarc), esetleg műanyag, pl. polisztirol lehet. Célszerű mérete 1,2 mmxl,2 mmx50 mm, és egyik felén polivinilalkohol (PVA) port tartalmazó dugó - két gyapot v. parafa réteg között - zárja. A 3. ábra mutatja a tartó vázlatát a szögletes 5 kapillárissal, a gyapot vagy parafa 6 réteggel, a PVA 7 dugóval, a 8 petesejttel, a 9 tápfolyadékkal és a hőtágulást kiegyenlitó 10 légbuborékkal. A 4. ábra a találmány szerinti eljáráshoz használható, folytonos argon lézer és fluoreszcencia mikroszkóp felhasználásával kialakított lehetséges elrendezést mutatja. A tárgy pontos pozicionálására X-Y irányban állítható 11 tárgyasztala szolgál. A 15 megfigyelő a 12 objektiven (10-25-szörös), a 14 okuláron (10-szeres) és a 13 dichroikus tükrön át látja a tárgyat. A 13 dichroikus tükör a zöldben reflektál, de a sárgában és vörösben átereszt. A lézerfény a folyamatos üzemű 19 lézerből (Ar-lézerből), melynek teljesítménye az 515 nm, ill. 488 nanométer hullámhosszakon 0-2 W között folyamatosan szabályozható, a 18 nyalábillesztó optikán át a 17 akusztooptikai modulátorra esik. Ez a ráadott vezérléstől függően 0,1-5 ms változtatható időtartamú impulzusok formájában engedi tovább a lézersugarat a 16 átképző és előfókuszáló optikai rendszeren át a 12 objektivre. A közbenső optikai rendszertől megköveteljük, hogy a lézernyalábot úgy képezze át, hogy a 12 objektiv aperturáját teljesen kitöltse, ugyanakkor a tárgy síkjában minimális foltméretet adjon. A 16 átképző és előfókuszáló optikai rendszer vagy a 18 nyalábillesztő optika helyén hengerlencsét alkalmazva vonalas folt nyerhető, ilyenkor azonban a 12 objektív rosszabb kitöltése és a hengerlencsék leképzési hibája miatt a foltméret kissé megnő. Hasonló vonalas folt érhető el az akusztocptikai deflektor megfelelő vezérlésével is, vagy egy forgó- ill. rezgótükör közbeiktatásával. Az 5. ábra egy másik, impulzuslézert és közönséges mikroszkópot felhasználó elrendezést mutat. A 11 tárgyasztalon levő embriót a 15 megfigyelő a 12 objektiven (5-10-szeres) és a 14 okuláron (10-szeres) át a hagyományos módon figyelheti meg. A lézersugár becsatolása a 12 objektív közelében elhelyezett 20 terelótükör segítségével történhet. Az impulzus üzemű Nd-üveg 19 lézer Q-kapcsolt üzemmódban 10-20 ns, 10-20 mJ energiájú impulzusokat sugároz ki 1,06 pm infravörös hullámhosszon. A lézersugár a 22 felharmonikus kristály segítségével 530 nm hullámhoszszű zöld fénnyé konvertálódik, mely a 21 nyalábformálón és a 23 fókuszáló optikán áthaladva a 20 terelő tükör segítségével a tárgyaikra képződik le. Ha a 23 fókuszáló optika egy hengerlencse, akkor vonalas folt kapható. Az egész rendszer úgy van beállítva, hogy a lézerfolt a tárgysíkban a 14 okulár fonalkeresztjének középpontjába essék. Az impulzusenergia adagolása a fényútba tett szűrőkkel vagy diafragmákkal szabályozható. A találmány fő előnyei a következők:- A lézeres embrió-darabolási módszernél nincs szükség különösebb ügyességre vagy begyakorlottságra. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
