191939. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ACTH1-32-fragmenst tartalmazó, nyújtott hatású gyógyszerkészítmény előállítására

4

191939

5

pn

0.5 mol/1 Zn2*

0.04 mol/1 Zn2* +0.01 mol/1 Ca2*

0.025 mol/1 Zn2' +0.025 mol/1 Ca2'

0,025 mol/1 Zn2*

0,05 mol/1 Ca2'

6.150

3.003

4.191

2.039

1.456

0.583

6.319

3.667

5.104

2.952

2.638

1.173

6.488

3.919

5.589

3.551

3.107

1.183

6.658

4.540

6.224

4.328

3.582

1.194

6.828

4.789

6.483

5.104

4.204

0.901

7.164

5.601

7.619

5.326

1.066

ACTH koncentráció: 5. ICM mol/1

Az 1. táblázatból látható, hogy az 15 ACTHi-32 cinkionok és a cink- és kalciumionok együttes hatására deprotonálódnak, azaz komplexek jönnek létre. A maximális hatás a 80 molX cinket és 20 mol% kalciumot tartalmazó rendszerben jelentkezett. 20

A technológiai kísérletek szempontjából számításba jövő pH 5,5 és 6,2 között a 0,05 mol/1 cink-ion-tartalmú rendszerben egy ACTH molekula a fém koordinációja hatására csak 3 protont, míg a 0,04 mol/1 cinkiont és 25 0,01 mol/1 kalcium-iont tartalmazó rendszerben már 4 protont enged el, tehát azonos összfémkoncentrációjú oldatokban a kalcium jelenléte a protonlekötésnek, illetve az ezt eredményező komplexképzésnek kedvez. 30

Ez a jelenség annál inkább váratlan, mert a kalciumion külön oldatban mért deprotonáló hatása még azonos koncentrációk esetén is lényegesen kisebb a cinkionénál.

Korábbi vizsgálatainkra [Metal Ions in 35 Biological Systems 9, 237 (1979)] támaszkodva cinkamalgám-elektródos egyensúlymérések segítségével meghatároztuk az ACTH 1-32 cinkionokkal képezett komplexeinek összetételét és egyensúlyi stabilitási állandóit. E 40 munka eredményeiből kitűnt, hogy egy polipeptid molekula a vizsgált pH- és koncentráció-tartományban maximum 13 cinkiont képes koordinative megkötni. Az egyensúlyi adatok 5 féle komplex (ZnïACTH, Zn6ACTH, ZnaACTH, 45 ZmoACTH) képződésére utaltak. A heteropolinukleáris komplex jellemzésére analóg módon elvégeztük a cinkion-koordináció egyensúlyi vizsgálatát az össz-cinkkoncentráció 20%-át kalciumionnal helyettesítve. A mérési adatok 50 számítógépi értékelése kimutatta, hogy a kalciumion-tartalmú rendszerben egységesebb és stabilabb komplex előállítására van mód.

A fentiek alapján a találmány eljárás nyújtott hatású ACTH 1-32-f rag menst tártál- 55 mazó injektálható gyógyszerkészítmény előállítására, amely abban áll, hogy 1 súlyrész ACTHi-32-peptidf ragmens vizes oldatát 1,8- -2,2 súlyrész cinkiont és 0,3-0,6 súlyrész kalciumiont tartalmazó vizes oldattal reagál- 60 tatjuk, a reakcióelegy pH-ját ásványi sav 1- -20%-os vizes oldatával 7,5-8,5 közötti értékre állítjuk, majd a kapott cink-kalcium- ACTH L-32-vegyes komplexet tartalmazó hatóanyagot ismert segédanyagok jelenlétében injekciós szuszpenzióvá alakítjuk.

A találmány szerinti eljárásban segédanyagként dinátrium-hidrogén-foszfátot, nát— rium-hidroxidot, nátrium-kloridot, benzil-alkoholt alkalmazunk.

A találmány egy előnyös kivitelezési módja szerint úgy járunk el, hogy az ACTH-peptid-fragmens vizes oldatát cink- és kalciumionokat meghatározott, előnyösen 4 : 1 arányban tartalmazó vizes oldattal reagáltatjuk, híg ásványi savval az elegy pH-ját 7,5- -8,5 közötti értékre állítjuk, majd az így kapott, kívánt esetben hígított, savanyú oldatot összehozzuk a segédanyagokat, előnyösen foszfát- és hidroxi-ionokat, valamint adalékanyagokat tartalmazó oldattal.

Egy további előnyös változat szerint az összes fémion és foszfátion arányát 7 : 1- -nél kisebb értékben állapítjuk meg.

A találmány szerinti eljárással előállított új heteropolinukleáris cink-kalcium-ACTH vegyes-komplexből az adrenokortikotrop-hormon hatású polipeptid csak lassan válik szabaddá, ami elnyújtott (retard) hormonhatást biztosít. Ennek ellenőrzése farmakológiai úton történt, és ez eredményeket az 1. ábrán mutatjuk be.

A vizsgálat alapja a kortikotropin szteroid genezist fokozó hatása: a patkány mellékvesekéreg fokozott mértékben termel és juttat a keringésbe kortikoszteront. Ezt az emelkedett kortikoszteron-szintet mérjük a készítmény vizsgálatánál az injektálást követő 0,5, 1, 2, 4 és 8 óra múlva, Purves és Sirett [Endocrinology 77, 366 (1965)] fluorimetriás módszerével.

Mint az 1. ábrán látható, a találmány szerint előállított készítmény (lásd A-görbe) jó elnyújtott hatást mutat. Ez a kedvező adat még 40 °C hőmérsékleten, 1 hónapos tárolás után is megmarad. Ezzel szemben kevésbé elhúzódó hatást biztosít a 152 235 sz. magyar szabadalmi leírásban ismerteit készítmény (lásd B-görbe), valamint a 4808 sz. francia gyógyszer-szabadalomban leírt gyógyszerkészítmény (lásd C-görbe).

A találmány szerinti eljárás legfőbb előnye tehát az, hogy az eljárással egyszerű módon, az eddig ismertnél jobban elnyúló hatású ACTH-tartalmú injekciós szuszpenzió készíthető. Ez a fokozott elnyúló hatás a létrejött nagyobb stabilitású újtipusú cink-kalcium-ACTH-komplex kialakításának tudható be.

4