191939. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ACTH1-32-fragmenst tartalmazó, nyújtott hatású gyógyszerkészítmény előállítására
2 191939 3 A találmány eljárás nyújtott hatású ACTHi-32-fragmenst tartalmazó injektálható gyógyszerkészítmény elöálllítására. Ismeretes, hogy az adrenokortikotrop-hormon hatású polipeptidek - akár állati r; eredetűek, akár szintetikus termékek - az emberi szervezetben gyorsan inaktiválódnak (proteolitikus enzim-hatások), ami gyógyszerként történő alkalmazásukat korlátozza. Ezért többen is foglalkoztak nyújtott (retard) ha- io tású, parenterális ACTH készítmények előállítási módjának kidolgozásával. Az ilyen készítmények a gyógyászati gyakorlatban széles körben alkalmazásra is kerültek. Az 1 040 186 ez. NSZK-beli szabadalmi 15 leírásból olyan ACTH-készitmények ismertek, melyekben a hormon a felszivódást késleltető fémoxiddal vagy fém-hidroxiddal, előnyösen cink-, nikkel-, kobalt-hidroxiddal vagy - foszfáttal van kombinálva. 20 A 151 393 sz. magyar szabadalmi leírás olyan ACTH-szuszpenziók előállítását ismerteti, amelyeknél cinket és valamely foszforoxidból leszármaztatható savat, észtert vagy sót olyan mennyiségben adagolnak, hogy 1 mg 25 ekvivalens cinkre mintegy 0,1-0,5 mg ekvivalens foszfát-ion jut. A 152 235 sz. magyar szabadalmi leírás szerint eljárva az ACTH-peptídet vizes közegben fém-sóval, - hidroxiddal, vagy oxid- 30 dal reagáltatva komplexet képeznek. Fémként előnyösen cinket, nikkelt, kobaltot, rezet vagy vasat alkalmaznak. Ugyancsak cink-komplex felhasználásán alapul a C.A. 69 107. old. helyen referált 35 4808 sz. francia gyógyszer-szabadalmi leírásban ismertetett eljárás. Összefoglalva tehát, a retard ACTH előállításával foglalkozó eljárások azon alapulnak, hogy a különböző adrenokortikotrop- 40 -hormon hatású természetes vagy szintetikus polipeptidek nehezen oldódó - és így a hatóanyagot lassan leadó - vegyületeit, esetleg komplexeit alakítják ki. E célból a peptid hatóanyagot szervetlen vegyületekkel, fém- 45 sókkal, polifoszfátokkal vagy szerves anyagokkal (például zselatinnal, polividonnal, polifenolok vagy polialkoholok foszforsav-észtereivel, poliaminosavakkal) reagáltatják és a keletkező, vízben rosszul oldódó termékeket alkalmazzák injekciós készítmények hatóanyagaként. Az így előállított termékek retard hatásának mértéke azonban már nem elégíti ki a mai, korszerű követelményeket. A találmány célja tehát olyan eljárás kidolgozása, mellyel az eddig ismertnél kedvezőbb, nyújtott hatású ACTH-komplexet tartalmazó gyógyszerkészítmény állítható elő. Munkánk során elvégzett koordinációs-kémiai és biológiai vizsgálataink arra utaltak, hogy a fémkomplex egyensúlyi stabilitásénak növekedése a retard hatásnak kedvez. Ezért gyógyszertechnológiai célunk az volt, hogy minél nagyobb stabilitású komplexben kössük meg polipeptidet. Ismeretes, hogy a 32 aminosavrészból álló szintetikus humán-ACTHi-32-polipeptid molekulára nagyszámú, különböző donoratomot tartalmaz, amelyek a fémionokkal komplexet képeznek (azokat koordinatív kötéssel megkötik). Például a kortikotropin szintetikus humán N-terminális 32 aminosavból álló fragmense (ACTH1-32) az alábbi komplexképző funkciós csoportokat tartalmazza: 5 karboxilcsoport, 5 primer aminocsoport, 3 guanidincsoport, 1 imidazol-nitrogén, 1 tioétercsoport, 1 savamid-, 2 fenolos hidroxidcsopçrt, 31 peptid-nitrogén- és 31 peptid oxigénatom. Ezt a jelentős komplexképzó-hajlamot az irodalomban eddig mindig úgy használták ki, hogy egyfajta fémiont alkalmaztak. Vizsgálataink során meglepő módon azt találtuk, hogy a polipeptidek fémkomplexei stabilabbak, ha fémionként polarizálható ún. .soft'-ionok [JACS, 85, 3533 (1963)) és merev ún. .hard'-ionok [JACS, 85, 3533 (1963)] keverékét használjuk. Kísérleteink során megállapítottuk, hogy - bár a kalcium komplexképző hajlama önmagéban ismert - meglepő módon a cink-kalcium vegyes ACTH-komplexek bizonyultak a legstabilabbaknak. Miután az adott fémionok komplexképző funkciós csoportokhoz való koordinációja protonledobással jár, a stabilitást pH-metriás mérésekkel tudtuk követni. Az eredményeket az 1. táblázatban foglaltuk össze: 1. táblázat Az ACTH fémionok hatására bekövetkező deprotonálódása vizsgálatának eredményei PH 0.5 mol/1 Zn2* 0.04 mol/1 Zn2* +0.01 mol/1 Ca2* 0.025 mol/1 Zn2* +0.025 mol/1 Ca2* 0,025 mol/1 Zn2' 0,05 mol/1 Ca2* 4.460 1.909 2.246 0.572 0.343 0.572 4.798 2.614 2.970 1.211 0.605 0.847 5.135 3.089 3.720 1.285 1.285 0.899 5.304 3.110 3.888 1.452 1.452 0.924 5.474 3.192 4.124 1.626 1.355 1.084 5.811 3.069 4.097 1.556 1.273 0.707 3
