191861. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glükóz-tartalmú cukorlé izomerizálására
1 191 86t 2 Az eredmények azt mutatják, hogy 55,2% fruktózszintet értünk el, míg a pszikóz-tartalmat szárazanyagra számítva 0,2 tömeg% alatt tartottuk. 3. Példa Ez a példa glükóz 57,2% hozamú, kétfokozatú izomerizációs eljárással történő fruktózzá izomerizálását mutatja be, melynek során az első reaktor 70 °C-on, a második (magas hőmérsékletű) 110,4°C-on üzemelt. A magas hőmérsékletű reakcióban használt, kémiailag stabilizált izomerázban az enzimet kovalens kötések kapcsolták egy oldható polimerhez, és e komplexet oldhatatlanná téve alakítottuk ki a rögzített katalizátort. Az első fokozatba bevitt szubsztrátum és a reakció körülményei megegyeztek az 1. példában leírtakkal. A 110,4°C-on működő, magas hőmérsékletű reaktorban alkalmazott rögzített katalizátor szintén megegyezett az 1. példában ismertetettel. Ez utóbbi reaktort az alábbi módon készítettük elő. A katalizátorból 28,4 g-nyi mennyiséget a szubsztrátumban szuszpendáitunk, és szobahőmérsékleten 60 percig laboratóriumi vákuum alatt légtelenítettünk. A légtelenített zagy felhasználásával köpenyes üvegkolonnában 2,5X 12,4 cm méretű töltetágyat képeztünk ki, melynek össz-aktivitása 10,885 IGIU volt. Az első fokozatú, 70 C-os izomerizáció termékeként kapott szubsztrátumot szárazanyagra számítva 42,0 % töménységűre hígítottuk, és pH-ját 6,47-re állítottuk be, majd 60 °C hőmérsékleten, 82,7X 103 Pa nyomás alatt, 3,38 ml/perc sebességgel 30 percig keringettük a magas hőmérsékletű reaktoron keresztül. A kolonnán belüli hőmérsékletet egy közvetlenül a töltet-ágy felett elhelyezett, és a holttér lehető legkisebbre csökkentése végett 0,3 cm átmérőjű üveggyöngyökkel körülvett hőmérő segítségével követtük. 30 perc elteltével a hőmérsékletet gyorsan megemeltük i i 1 °C-ra termosztált olajnak a köpenyben való cirkuláltatásával. Az oszlopról lejövő termék minőségét 50-58 % közötti fruktóz-tartalom leolvasására kalibrált regisztrálópolariméterrel mértük. Miután a kolonna hőfoka a 110,4°C-ot, a termék fruktóz-tartalma pedig a kívánt szintet elérte, a terméket összegyűjtöttük, jégfürdőben azonnal lehűtöttük, és pH-ját 1M koncentrációjú citromsav hozzáadásával 4,0-re állítottuk be. A 70 és 110,4 °C-on működő reaktorokban izomerizált oldatokat szénhidrát-összetételre és színerősségre nézve elemeztük, majd az adatokat az izomerizálatlan oldaton végzett hasonló vizsgálatok eredményével összehasonlítottuk, amint a 3. táblázat mutatja. Az eredmények azt mutatják, hogy 57,2 % fruktózr.zintet értünk el, miközben a pszikóz-tartalom szárazanyagra számítva 0,4 tömeg%, a színerősség pedig (CIRFX100) 20 alatt maradt. 5 4. Példa Ez a példa egy túlnyomórészt tisztított kukoricáit) keményítő hidrolizátumból álló glükóz-tartalmú oldat 56,3 % fruktóz-szint elérésére vezető közvetlen kétfokozatú izomerizációját mutatja be. Az első lépésben 70 °C-on alacsony hőmérsékletű izomerizációt végeztünk, melynek termékét egy második, nagyhőmérsékletű 15 (103,3 °C), kémiailag stabilizált izomerázt tartalmazó reaktorba tápláltuk be. Ebben az izomerázban a kémiai stabilizációt egy védő-proteinnel való kapcsolat biztosítja (élesztőből származó védőfehérjéről van szó). Az alacsony hőmérsékletű izomerizációs lépés, bele- 20 értve a szubsztrátumot és a kísérleti körülményeket, ugyanaz volt, mint az 1. példában. A magas hőmérsékletű reaktorban alkalmazott, kémiailag stabilizált glükóz-izomeráz enzimet az alábbi módon készítettük. A kémiai stabilizációra szánt old- 25 ható glükóz-izomeráz előkészítése és tisztítása az 1. példában leírt módszer szerint történt. E készítmény fajlagos aktivitása hozzávetőlegesen 40 IGIU/mg protein volt. A védő-proteint sütőélesztőből a következő eljárással kaptuk. 1229 g sütőélesztő nedves masszájához 1000 g 30 vizet és 500 g toluolt adtunk. A keveréket szobahőmérsékleten egy éjszakán át kevertük, majd 85 °C-ra melegítettük, és ezen a hőfokon tartottuk kb. 30 percig. Ezután Büchner-tölcséren átszűrtük; közel az egész íoluol-mennyiség az oldhatatlan sejttörmelékben maradt, 35 míg a vizes szűrlet az oldható élesztő-kivonatot tartalmazta. E vizes szűrletet rotációs bepárlóban 40°C-on 276 g-nak megfelelő térfogatúra csökkentettük, majd keverés közben 41 g triklórecetsavat adtunk hozzá. A kiisapódott élesztő-proteint összegyűjtöttük, és 0,1M kon- 40 centrációjú nátrium-foszfát pufferoldatban (pH = 7) ismét feloldottuk. Szűréssel eszközölt fehérítés után az oldatot 900 ml (kb. háromszoros térfogatrész) acetonnal kezeltük. A csapadékot felvettük, 0,01M töménységű nátrium-foszfát pufferben (pH = 7,0) feloldottuk, és a 45 kapott, oldatot 0,01M töménységű nátrium-foszfáttal szemben dializáltuk. A dialízis termékét neveztük el sütőélesztőből nyert védő-proteinnek. (Mennyisége 150 ml volt.) Ezután 24 g kitozán (Kytex a Hercules Inc.-tői, Wilmington, Delaware) 4 liter 0,08n sósavoldat- 50 ban való feloldásával 0,6 %-os kitozán-oldatot készítettünk. Az oldat pH-ját 8n nátrium-hidroxiddal 6,2-re 3. Tablázii 70 és 110,4 °C-on izomerizált szubsztrátuvnok összetétele Kezelési mód Szénhidiát összetétel (hamumentes szárazanyagra vetített tömeg%-ban) Fruktóz Glükóz Pszikóz Poliszacharid Színerősség (CIRFX100) Izomerizálatlan 0 99,2 0 0,8 0,6 70 °C-on izomerizált 52,3 46,9 0 0,8 0,7 110,4 °C-on izomerizált 57,2 41,5 0,3 1,0 19,8 10
