191861. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glükóz-tartalmú cukorlé izomerizálására
1 191 861 2 állítottuk be, Whatman-típusú 3 fokozatú szűrőpapíron átszűrtük, és 16 liter ionmentes vízzel szemben dializáltuk. Egy 400 ml-es főzőpohárba betettünk mintegy 100,000 IGIU aktivitást képviselő oldható glükóz-izomeráz enzimet (derítőanyaggal összekeverve), továbbá 1 g xilitet és 100 ml (2/3), sütőélesztőből nyert védőproteint. Ehhez az elegyhez hozzáadtunk még 2,4 mg hűtöttük jégfürdőben, és pH-ját moláris citromsav hozzáadásával (0,1 ml) hozzávetőleg 4,0 értékre állítottuk be. A 70 és 103,3 °C-on végzett izomerizációk termékét szénhidrát-összetételre és színerősségre nézve elemeztük, 5 és az eredményeket - mint azt a 4. táblázat mutatja — az izomerizálatlan szubsztrátum-oldaton végzett azonos vizsgálatok adataival összehasonlítottuk. 4. Táblázat 70 és 103,3 °C-on izomerizált szubsztrátum-oldatok összetétele Kezelési mód Szénhidrát összetétel (hamumentes szárazanyagra számított tömeg%-ban) Fruktóz Glükóz Pszikóz Poliszacharid Színerősség (CIRFX100) Izomerizálatlan 0 97,6 0 2,4 0,5 70 °C-on izomerizált 513 46,4 0 23 0,7 103,3 °C-on izomerizált 56,3 41,5 0,1 2,2 34,0 MgS04.7H2 O-t és 24 mikroliter moláris kobalt(Il)-klorid 25 oldatot. Az elegyből a derítőanyagot szűréssel eltávolítottuk, a szűrletet (kb. 40°C-on, rotációs bepárlóval) csaknem száraz állapotig tönrényítettük egy 2 literes gömblombikban. A lombik tartalmához 800 ml kitozánoldatot (pH = 6,2) öntöttünk, és az elegyet újból közel 30 száraz állapotig bepároltuk (kb. 40°C-on, rotációs bepárlóval), majd 640 mikroliter 6,5-re beállított pH-jú 50 %-os glutáraldehid-oldatot adtunk hozzá, és egy éjszakára hideg helyiségben állni hagytuk. Másnap a gélt kivettük a lombikból, áthajtottuk egy 0,390 mm lyuk- 35 bőségű szitán, és 37 °C-on teljesen megszárítottuk. A száraz enzim-készítményt a porszerű finom részek eltávolítása végett szitán átszitáltuk, és az így kapott terméket (8,9 g) használtuk a magas hőmérsékletű izomerizációhoz. 40 A 103,3 °C-on működő reaktort a következő módon készítettük elő. A fenti (8,9 g) glükóz-izomeráz készítményt a szubsztrátumban szuszpendáltuk, és szobahőmérsékleten, laboratóriumi vákuum alatt 30 percig légtelenítettük. A légtelenített szuszpenzió felhasználásával 45 1,5X29 cm méretű töltet-ágyat képeztünk ki egy köpenyes üvegkolonnában. ■ A 70 °C-on végzett első izomerizációs lépés termékéből készített szubsztrátumot szárazanyagra számítva 42,0 % töménységűre hígítottuk, és pH-ját 6,75-re állí- 50 tottuk be, majd 60 °C hőmérsékleten, 1,5 ml/perc sebességgel 30 percig keringettük a reaktorkolonnán keresztül. A kolonnán belüli hőmérsékletet egy közvetlenül a töltet-ágy felett elhelyezett, a holttér minimalizálása érdekében 0,5 cm átmérőjű üveggyöngyökkel körülvett 55 hőmérő segítségével követtük. A fentírt keringetési idő leteltével a hőmérsékletet gyorsan megemeltük 104 °C-ra termosztált olajnak a kolonnaköpenyben való cirkuláltatása útján. A lejövő terméket 50-58 % közötti fruktóz-tartalom 60 leolvasására kalibrált regisztráló polariméterrel ellenőriztük minőségileg. Időnként kb. 5 ml-es mintákat vettünk mindaddig, amíg 55 %-os, vagy azt meghaladó mértékű fruktóz-képződést tapasztaltunk, amikoris a kísérletet befejeztük. A mintavétel alatt a terméket azonnal le- 65 Az eredmények azt mutatják, hogy 56,3 % fruktózszint volt elérhető, miközben a szárazanyagra számított pszikóz-tartalom 0,2 tömeg% alatt maradt. 5. Példa Ez a példa egy túlnyomórészt tisztított kukoricakeményítő hidrolizátumból álló, alacsony só-koncentrációjú glükóz-tartalmú oldat szárazanyagra számítva 55,4 %-os fruktóz-szint elérésére vezető közvetlen, kétfokozatú izomerizációját mutatja be. Előzetesen egy 70 °C-on lejátszódó alacsony hőmérsékletű izomerizációt végeztünk, és ennek a reakciónak a termékét használtuk fel kiindulási anyagként egy kémiailag stabilizált izomerázt tartalmazó második, ún. magas hőmérsékletű reaktorhoz. A kémiailag stabilizált izomerázban az enzimet több ponton keresztül kovalens kötésekkel kapcsoltuk egy oldható polimerhez, majd oldhatatlanná téve rögzített katalizátorrá alakítottuk. A hidrolizátumot a 3,644,126 számú USA szabadalmi leírásban (elfolyósítás) és a 3,280,006 számú USA szabadalmi leírásban (elcukrosítás) ismertetett eljárások szerint kukorica-keményítőből készítettük. Az elcukrosított levet a 3,834,940 számú USA szabadalmi leírás szerint tisztítottuk; így 93,8% glükózt tartalmazó terméket kaptunk (szárazanyagra számítva). Azért, hogy a szárazanyagra számított glükóz-tartalmat 96,9 %-ra növeljük, megfelelő mennyiségű kristályos glükózt adtunk hozzá. Az ily módon előállt oldat a következő összetételű volt: Összes szárazanyag (%) 50,3 Glükóz (szárazanyag %-ában) 96,9 Fruktóz (szárazanyag %-ában) 0,1 Poliszacharid (szárazanyag %-ában) 3,1 Pszikóz (szárazanyag %-ában) 0,0 Nátrium-hidrogén-szulfit (mM) 2,5 Magnézium-szulfát (mM) 2,5 Kobalt(II)-klorid (mM) 0,1 PH 6,8 11
