191861. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glükóz-tartalmú cukorlé izomerizálására
1 191 861 2 Leggyakrabban bifunkciós vinil-vegyületeket viszünk be (az összes monomerre számítva 0.1—5 % mennyiség ben) a monomer elegybe keresztkötéses helyek kialakítása céljából, amiáltal háromdimenziós polimer háló jön létre. Erre alkalmas vegyületek az N.N’-metiién-biszakrilamid és az etilénglikol-dimetakrilát. Ezek használatakor a polimerizátum oldhatatlan gél alakját ölti, amely az izomerázt megfelelően rögzíti. A vinil-polimerizációknál szokás szerint alkalmazott iniciálé rendszerek közül az alábbiak megfelelők: ammónium-perszulfát + nátrium-biszulfit, hidrogénperoxid + + ferro-szulfát, kálium-szulfát + N ,N,N',N'-te trame ti]etiléndiamin, és riboflavin (+ fény). Előbbiek mellett a polimer térhálóhoz kapcsolódó nem-kovalens kötés is elegendő lehet az izomeráz molekula kívánt stabilitásának eléréséhez, és ezáltal a termikus ellenállóképesség jelentős megnöveléséhez. Ez az eset akkor fordul elő, amikor az izomeráz egy keresztkötéses polimer gélen belül mechanikailag kötődik meg. Ilyenkor nem szükséges, hogy az izomerázt a polimerizációs lépést megelőzően egy vinilcsoport bevitelével módosítsuk. Mindenesetre, a gél koncentrációjának nagyobbnak kell lennie mint kb. 30 tömeg%, még mielőtt jelentős stabilizáció bekövetkeznék, de mintegy 50 %-os gélkoncentráció az előnyös. Olyan monomerek, mint pl. nátriumakrilát, nátrium-metakrilát, akrilamid és hidroxi-etilmetakrilát szükségesek, melyek képesek az izomerázzal elektrosztatikus és hidrogén kötéseket alkotó polimer gélek létrehozására. A stabilizálás génekbe való beépítéssel való megoldására Martinék és munkatársai (Biochem, Biophys. Acta 485, 1977, pp. 13—28), valamint Kulys és munkatársai (J. Solid Phase Biochem., 3, 1978, pp. 95—105) szolgálnak példákkal. Az izomeráz ellenállóvá tételének egyik módszere intramolekuláris keresztkötések létrehozása, ami az enzimnek további termikus stabilitást kölcsönöz. A stabilizáció e fajtájának példáit Torchilin és munkatársai (Biochem. Biophys. Acta 522, 1978, pp. 277- 283; Biochem. Biophys. Acta 568, 1979, pp. 1-10), továbbá' Martinék és munkatársai (J. Solid Phase Biochem., 2, 1977, pp. 343—385) tárgyalják. A jelen találmány szempontjából megfelelő keresztkötést létrehozó ágensek bifunkciós vegyüleíeket tartalmaznak, melyek képesek az enzim molekulán függő funkcionális csoportokkal reakcióba lépni. Az ilyen funkcionális csoportok leginkább aminocsoportok, általában olyan primer aminocsoportok, melyek reagálni tudnak a legkülönfélébb funkcionális csoportokkal, olyanokkal mint karbonsav, szulfonü-balogenid, aldehidek, izocianátok, propiolátok és hasonlók. Ennélfogva, a keresztkötést létrehozó ágensek közé sorolandók a dikarbonsav-anhidridek, mint pl. a borostyánkősav-anhidrid és adipinsav-anhidrid; a megfelelő dialdehidek, mint a glioxál, szukcinaldehid és glutáraldehid; telítetlen vegyületek, mint az akroleinés krotonaldehid, diol-propiolátok, mint az etilénglikol-biszpropiolát, propilénglikoi-biszpropiolát és hexametiJénglikoibiszpropiolát; továbbá diszulfonil-halogenidek mint pl. benzol-1,3-diszulfonil-klorid, naftalin-1,5-diszulfonil-klorid és tolil-2,4-diszulfonil-ldorid. Minthogy az enzim tartalmaz, vagy pedig elérhető, hogy tartalmazzon aminokkal reakcióképes savcsoportokat, jelen találmány szerint bifunkciós aminok szintén alkalmazhatók keresztkötést létrehozó ágensként. Ide tartoznak például a legfeljebb 12 szénatomot tartalmazó diaminok, nevezetesen a feniléndiamin, butiléndiamin, hexiléndiamin, oktiléndiamin, pentiléndiamin, etiléndiamin, és dodecil én diamin. A keresztkötést létrehozó ágens mennyisége jelentősen változhat, az enzim/keresztkötésképző ágens aránya 0.1-től 0.0001-ig terjedhet. A kívánt kötésrendszer kialakítására szolgáló módszert bizonyos mértékig a kiválasztott keiesztkötésképző ágens és az enzim természete határozza meg. Általában a reagenseket alkalmas közömbös oldószerben feloldjuk, és a reakciót ésszerűen alacsony hőmérsékleten folytatjuk le, hogy az esetleg hőérzékeny enzimet a káros behatásoktól megóvjuk. A reakciókat rendszerint szobahőmérsékleten, vagy1 ahhoz közelálló hőfokon valósíthatjuk meg előnyösen, és reakcióközegként vizet, vagy vizes oldószereket használunk. A polimerizálható vinilcsoportok enzim-molekulára történő helyettesítésén, majd az előbbiekben leírt módszerekkel történő polimerizálásán túlmenően további szilárdító lépést képez valamely előzőleg elkészített polimer kondenzálása az enzimmel intramolekuláris kovalens kötések kialakítása útján stabilizált molekula létrehozása céljából. Például polipeptideket, mint a természetben előforduló proteinek és hidrolízis-termékeik, ismert technikák segítségével peptid kötések révén a glükóz-izomerázhoz lehet kapcsolni, aminek eredményeként stabilizált enzim jön létre. Az így előállított termékek lehetnek vízoldhatók, de vízben oldhatatlanná is tehetők keresztkötésképző ágensek közreműködésével, például glutáraldehiddel, és az így előálló keresztkötéses enzimrendszer még stabilabb is. A peptidképző reakciókat ismert eljárásokkal valósíthatjuk meg, így például fcarbodiimidek felhasználásával. Kívárit esetben a kiinduló enzimbe megfelelő funkciós csoportok vihetők be az előzetesen preparált molekulával történő kondenzáció céljából. Ily módon például karboxi-furikcionalitás elérésére szabad aminocsoporttal rendelkező enzimet reagáltathatunk valamely dikarbonsawa], amiáltal az karboxilcsoportot tartalmazó enzimmé alakul át. Az előbbiekben említett szilárdító lépésre hasznait, előre kialakított polimer bármely olyan vegyület lehet, amelyik a szándékolt reakciók lejátszatásához megkívánt tipusű és mennyiségű funkcionális — például amino-vagy karboxiJcsoporíot tartalmazza. Előnyösek e szempontból a polipeptidek, ezek közül is a természetes proteinek, mint például a kitozán, az élesztő-fehérje és hasonlók, valamint keverékeik, továbbá előnyösek még az aminocsoportot tartalmazó polimerek, mint a polietilénimin. Rendszerint az előnyben részesített előre-elkészített polimer vízoldható termékeket képez, és előnyösebb, ha ezeket keresztkötést létrehozó ágensekkel, például glutáraldehiddel, vagy az előzőekben leírt egyéb vegyüiettel reagáltatva oldhatatlanná tesszük. . Az ismertetett összes enzim-módosító módszernél lényeges, hogy a kívánt eredmény hatásos szinten való realizálása érdekében a szükséges mennyiségű funkcionalitást, így pl. amino-vagy karboxilcsöpörtök jelenlétét megfelelően biztosítsuk. Az előzőek értelmében például amikor az enzimmel reagáltatandó előre-elkészített polimert kiválasztjuk, az szükséges, hogy a polimer olyan csoportokat tartalmazzon, melyek az enzim-molekulán meglévő csoportokkal reakcióba vihetők. így tehát egy függelékes karboxil-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
