191861. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glükóz-tartalmú cukorlé izomerizálására
1 191 861 2 csoportokat tartalmazó proteint fogunk kiválasztani függelékes aminocsoportokkal rendelkező enzimmel történő reakcióhoz. Továbbá, a kiválasztott reaktánson a reaktív csoportok olyan célszerű számban kell jelen legyenek, hogy biztosítsák a hatásos stabilizációhoz elengedhetet- 5 len többpontú kapcsolódást. Az ilyen reaktív csoportok jellegének és számának a megfelelő reagensekhez illeszkedő meghatározása természetesen a szakember számára nem jelent nehézséget. Az enzimek termostabilitásának növelésére szolgáló 10 még egy további módszer abban áll, hogy észrevehető aktivitáscsökkenés nélkül kémiai úton megváltoztatjuk a felületi szerkezetet. Ilyenformán felületi aminocsoportok amidokká alakíthatók, (Ludwig, M. L. és Hunter, M. J., Meth. Enzymol. 11, 1967, pp. 595-604) vagy 15 guanidinekké (Kimmel, J. R.,Meth. Enzymol. 11, 1967, pp. 584—589) alakíthatók argininhez teljesen hasonló szubsztituensek előállítása céljából. Tejdehidrogenáz és sok más fehérje stabilizálásáról számolnak be a következő közlemények: Tuengler, F. és Pfleiderer, G., Bio- 20 ehern. Biophys. Acta, 284, (1977), pp. 1-8; Minotani, N. és munkatársai, Biochem. Biophys. Acta, 581, (1979) pp. 334—341; továbbá Cupo, P. és munkatársai, J. Bioi. Chem., 255, (1980) pp. 10 828-833. Az oldható izomeráz készítmény aktivitását a Lloyd 25 és munkatársai által leírt (Cereal Chemistry, 49, no. 5. 1972, pp. 544-553) módon határoztuk meg. Egy IGIU egység azzal az izomeráz mennyiséggel egyenértékű, amely literenként 2 mól glükózt, 0,02 mól magnéziumszulfátot, és 0,001 mól kobalt(II)-kloridot tartalmazó 30 oldatban, 6,85 pH (0,2 mól nátrium-maleát) mellett, 60 °C hőmérsékleten 1 perc alatt 1 mikronról glükózt alakít át fruktózzá. A következő példák a jelen találmány szerinti eljárás további bemutatására szolgálnak, 35 Poliszacharid (% a szárazanyagra) 2,4 Pszikóz (% a szárazanyagra) 0,0 Nátrium-hidrogén-szulfát (mM) 50,0 Magnézium-szulfát (mM) 5,0 Kobalt(II)-klorid (mM) 0,1 pH 6,8 Az alacsony hőmérsékletű izomerizálást 70QC-on, a fenti szubsztrátum-oldat 3,2 ml/perc sebességgel történt, az alacsony hőmérsékletű reaktoron való átszivattyúzásával folytattuk le. Az alacsony hőmérsékletű (70 °C) reaktort úgy állítottuk össze, hogy az amerikai 3,788,945 számú szabadalmi leírás szerint készített DEAE-cellulózon rögzített izomerázt 2,54 cm átmérőjű, be- és kivezetéssel, valamint termosztált víz keringetésére szolgáló köpennyel ellátott üvegkolonnába töltöttünk. A töltet feletti térbe hőmérőt helyeztünk, és teleraktuk üveggyöngyökkel, hogy amennyire csak lehet, csökkentsük a holtteret. A reaktor 20,000 IGIU aktivitás kifejtéséhez elegendő rögzített izomerázt tartalmazott, s a töltet-ágy kb. 15 cm magasságú volt. A kilépő termék első 1000 ml-ét elöntöttük, majd az utána érkező folyadékot a második, magas hőmérsékletű izoinerizációhoz összegyűjtöttük. A magas hőmérsékletű reaktorban használt, kémiailag stabilizált katalizátort az alábbi módon készítettük: A S. rubigenosus ATCC 21175-ből származó egyik Streptomyces rubigenosus fajt vízalatti aerob fermentációval a következő táblázat szerinti összetételű tápoldatban tenyésztettük: tömeg% 1. Példa E példa túlnyomórészt finomított kukorica-keményítő hidrolizátűmből álló glükóz-tartalmú oldat szárazanyagra számítva 55,5 % fruktóz-összetétel elérése céljából történt közvetlen izomerizálását mutatja be, amit kétlépcsős izomerizációs eljárás alkalmazásával valósítottunk meg. Először 70 °C-on alacsony hőmérsékletű izomerizálást végeztünk, melynek termékét egy kémiailag stabilizált izomerázt tartalmazó, magasabb hőmérsékleten (105,2 °C) működő második reaktorba tápláltunk be. E kémiailag stabilizált izomerázban az enzimet kovalens kötésekkel kapcsoltuk egy oldható polimerhez, majd rögzített katalizátorrá alakítása végett oldhatatlanná tettük. A hidrolizátumot kukorica-keményítőből a 3,644,126 számú (clfolyósítás) és 3,280,006 számú (elcukrosítás) amerikai szabadalmi leírásokban leírt módon készítettük. Az elcukrosított levet szárazanyagra számítva 95,3 % glükózt tartalmazó termék előállítása céljából a 3,834,940 számú amerikai szabadalmi leírás szerint finomítottuk. Szárazanyagra számítva 97,6 %-os glükóz-összetételre megfelelő mennyiségű kristályos glükóz hozzáadásával javítottuk fel. Az így létrejött oldat összetétele a következő volt: 40 45 50 55 60 Összes szárazanyag (%) 50,2 Glükóz (% a szárazanyagra) 97,6 Fruktóz (% a szárazanyagra) 0,0 65 Glükóz Kukoricalekvár Diammónium-foszfát Mangán-szulfát Habzásgátló (Pluronic PL-61) 9,0 1,6 (szárazanyag) 0,08 0,06 0,003 A tápoldatot 121 °C hőmérsékleten 45 percen keresztül sterilizáltuk, majd hűtés után pH-ját 6,8-7,0 értékre állítottuk be. Ezt követően egy inokulum-fermentorban előállított S. rubigenosus variánssal készített oltóanyag 14 térfogat%-nyi mennyiségével beoltottuk. A fermentáció 30°C-on aszeptikus körülmények között mintegy 60 óra alatt 0,65 térfogat/térfogat mértékű levegőztetéssel játszódott le. A S. rubigenosus ATCC 21175 is felhasználható oltásra és izomeráz termelésére; ebben az esetben a tápoldat összetétele a következő: tömeg% Glükóz 0,24 Kukoricalekvár 1,5 (szárazanyag) Szerbit 1,6 Kobalt(II)-klorid 0,02 Diammónium-foszfát 0,56 Xilóz 1,0 7
