191861. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glükóz-tartalmú cukorlé izomerizálására
1 191 861 / Az alacsony hőmérsékletű izomerizálás során az előzőekben említett szubsztrátumot 70°C-on 2,5 ml/perc sebességgel szivattyúztuk keresztül az 1. példában leírttal azonos alacsony hőmérsékletű reaktoron. A reaktorból kilépő első 1000 ml terméket elöntöttük, az azután keletkezőt pedig a második, magas hőmérsékletű izomerizáció céljára összegyűjtöttük. A magas hőmérsékletű reaktorban alkalmazott, kémiailag stabilizált katalizátort az alábbi módon készítettük. Az 1. példában leírt módszer szerint készített és tisztított oldható glükóz-izomerázból indultunk ki. E készítmény fajlagos aktivitása mintegy 40 IGIU/mg protein volt. Ezután 48,4 g kitozánt (Kytex a Hercules Inc.-től, Wilmington, Delaware 19899) 15 liter 0,08n sósavban feloldottunk, miáltal egy oldható poliamin polimer-oldatához jutottunk. Miután a kitozán feloldódott, 438 g nátrium-klorid hozzáadásával 0,5M töménységű nátriumklorid-oldatot képeztünk, melynek pH-ját 8n nátriumhidroxiddal 6,1 értékűre állítottuk be. Ezt azelegyet azután az oldhatatlan részek eltávolítása végett Whatmanféle 3 fokozatú szűrőpapíron átszűrtük. A 6,1 pH-jú, 15 liternyi, 0,5M nátrium-klorid koncentrációjú 0,3 %-os kitozán -oldathoz még a következő anyagokat adtuk: 520 ml mennyiségű, hozzávetőlegesen 602,000 1G1U aktivitású oldható izomerázt, 236 g xilitet (a Sigma Chemical Co.-tól), továbbá 3,07 gMn€i2.4H20-t. Az így előállt elegyet 2 órán át kevertük, majd 7,44 g l-etil-3- dimetil-amino-propil-karbodiimidet (a Sigma Chemical Co. termékét) adtunk hozzá, hogy több ponton keresztül kovalens kötések alakuljanak ki az izomeráz karboxilcsoportjai és a kitozán aminocsoportjai között. Két óra .múlva szobahőmérsékleten 15,5 ml mennyiségű, 8n nát.rium-hidroxiddal 6.0 pH-ra beállított 50 térfogat% töménységű glutáraldehid-oldatot (Eastman Kodak Chemical Co.) adtunk végül hozzá, mellyel az izomeráz-kitozán 2 lenített zagy felhasználásával köpenyes üvegkolonnában 1,0X40 cm méretű töltet-ágyat képeztünk ki. A töltet 5621 IGIU-nak megfelelő katalizátort tartalmazott. A 70 °C hőmérsékleten lefolytatott izomerizáció ter- 5 mékéből előkészített szubsztrátum pH-ját 6,55-re állítottuk be, ionmentes vízzel szárazanyagra számítva 42,0 % töménységűre hígítottuk, amiáltal a sókoncentráció is csökkent, nevezetesen a nátrium-hidrogén-szulfité is, és a magnézium-szulfáté is 2,1 mM-ra. Ezt a szubsztrátu- 10 mot azután 82,7X 103 Pa nyomás alatt 10 percig keringtettük 8 ml/perc sebességgel a magas hőmérsékletű reaktorkolonnán keresztül, egyelőre 60°C-os hőfokszinten. A kolonnán belüli hőmérsékletet egy közvetlenül a töltet-ágy fölött elhelyezett, és a holttér lehető legkisebbre 15 csökkentése érdekében homokkal a hőfok-skáláig körülvett hőmérő segítségével követtük. A fenti keringtetési idő letelte után 114°C-ra termosztált olajnak az olajfürdő és a kolonnaköpeny közötti cirkuláltatásával gyorsan megemeltük a reaktor hőmérsékletét 112,6°C-ra, 20 ugyanakkor az áramlási sebességet 1,89 ml/perc értékre nérsé keltük. A kolonnából távozó termék minőségét 50—58 % közötti fruktóz-tartalom leolvasására kalibrált regisztráló polariméterrel ellenőriztük. Miután a kolonnahőmérsék- 25 1 ‘te a 112,6°C-ot, a tennék fruktóz-tartalma pedig a kívánt szintet elérte, a terméket összegyűjtöttük, és pH- j ít 1M koncentrációjú citromsav hozzáadásával azonnal 4,0-ra szabályoztuk. A terméket mindaddig gyűjtöttük, míg a fruktóz-szint 55 % alá nem esett. 30 A 70 és a 112,6 °C-on üzemeltetett reaktorok izomerizált végtermékét szénhidrát-összetételre és színerőssígre nézve elemeztük, az adatokat pedig az 5. táblázat tanúsága szerint összehasonlítottuk az izomerizálatlan szubsztrátum oldat azonos jellemzőinek elemzési ered- 35 erényeivel. 5. Táblázat 70 és 112,6 °C-on izomerizált szubsztrátumok összetétele Kezelési mód Szénhidrát összetétel (hamumentes szárazanyagra számított tömeg%) Fruktóz Glükóz Pszikóz Poliszacharid Színerősség (CIRFX100) Izomerizálás nélkül 0 96,9 0 3,1 0 70 °C-on izomerizálva 51,4 45,9 0 2,7 0 112,6 °C-on izomerizáh a 55,4 42,0 0,1 2,5 8,5 kovalens kötésű komplexet oldhatatlanná tettük. 15 perccel később 8,0 pH-jú, 1M koncentrációjú foszfátoldatból 4 liternyit az oldhatatlan izomeráz-kitozánhoz kevertünk. Ezt követően a rögzített izomeráz-kitozánt Whatman-féle 3 fokozatú szűrőpapírral bélelt Buchnertölcséren ionmentes*vízzel vákuum alatt gyorsan átmostuk, a készítményt levegőn megszárítottuk, megtörtük, és 0,725—0,180 mm lyukbőségű sziták között átszitáltuk. A száraz katalizátor 803 IGIU/g aktivitást mutatott. A 112,6 °C hőmérsékleten működő reaktort a következőképpen készítettük elő. A katalizátorból 7,0 grammnyi mennyiséget a szubsztrátuntban szuszpendáltunk, és a szuszpenziót szobahőmérsékleten, laboratóriumi vákuum alatt 60 percen keresztül légtelenítettük. A légte-Az eredmények azt mutatják, hogy 55,4 % fruktózszintet értünk el, míg a pszikóz-tartalom szárazanyagra számítva 0,2 tömeg%, a színerősség pedig 9 (CIRFX100) 55 érték alatt maradt. 6. Példa Ez a példa egy túlnyomórészt tisztított kukoricakeményítő hidrolizátumból álló, alacsony sótartalmú 60 glükóz-oldat közvetlen izomerizációját mutatja be, melynek során kétlépcsős izomerizálási eljárást alkalmaztunk, és rendkívül alacsony pszikóztartalom (0,1 % alatti) valamint igen csekély (2 CIRFX100 értéknél kisebb) színerősség mellett szárazanyagra számítva 54,8 %-os fruk- 65 tóz-koncentrációt értünk el. Az első (alacsony hőmér12
