191849. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gyógyászati hatású vegyületek és ezeket tartalmazó készítmények előállítására új hromobacterium violaceum törzs felhasználásával
7 191849 8 foszfátokat,kalcium-karbonátot és magnéziumszulfátot. Ha szükséges nyomnyi mennyiségben más fémsók is alkalmazhatók. A fenti anyagok bármelyikét a tenyésztés során addig alkalmazhatjuk, amig segítik és nem gátolják az Arphamenine termelést. A találmány szerinti eljárásnál bármely, a baktériumok tenyésztésénél alkalmazott anyag használható. Különösen előnyös komponensei a tápközegnek szénforrósként a glicerin és az oldható keményítő, nitrogénforrásként a szójabab-liszt, a hal-liszt és a kukorica-sikér-liszt. A tápközeg tartalmazhat például 1,5% glicerint, 1,5% oldható keményítőt, 0,5% Prorich-t, (beszerezhető: Ajinomto, Daza Morotomitsu 453 Saga, Japán) 1,5% hal-lisztet és 0,2% kalcium-karbonátot. Egy másik összetétel szerint 3% oldható keményítőt, 0,5% Prorich-t, 1,2% gabona-sikér-lisztet és 0,2% kalcium- karbonátot. A találmány szerinti eljárásnál előnyös a folyékony tápközeg, a nagyobb mennyiségű Arphamenine termelése érdekében. A tenyésztés hőmérsékletét aszerint választjuk meg, hogy az az Arphamenine termelést elősegítse. Előnyös a 25° és 35 °C közötti hőmérséklet. A tenyésztést általában addig végezzük, amig megfelelő mennyiségű anyag halmozódik fel a tápközegben. A tenyésztést például a következők szerint végezzük: a 3% oldható keményítőt, 0,5% Prorich-t, 1,2% kukorica-sikér-lisztet és 0,2% kalcium-karbonátot tartalmazó tápközeget sterilizáljuk, majd kacsnyi mennyiségű Arphamenine-termelő mikroorganizmus ferde tenyészetével beoltjuk. A beoltást aerob körülmények között rázótenyészetben 27 °C-on végezzük. 8-52 óra elteltével az Arphamenine felhalmozódik. Az Arphamenine előállítását sikeresen végezhetjük rázótenyésztésen kívül tanktenyésztéssel is. Ebben az esetben például 300 liter tápközeget egy 570 literés fermentációs tartályba helyezzük, sterilizáljuk és a tenyésztést 190 fordulat/perc keverés mellett 300 1/perc steril levegő adagolásával végezzük. Ilyen feltételek mellett az Arphamennine képződés 23 óra alatt éri el a maximumát. A tenyésztés, valamint tisztítás során az Arphamenine-t az amino-peptidáz B-vel szemben kifejtett inhibiciós hatásának mérésével határozzuk meg, V.K. Hoppusu, K.K. Makinen és G.G. Glenner (Archives of Biochemistry and Biophysics 114, (1966), 557) módosított eljárása szerint, a következőképpen: 0,5 ml 0,1 mólos triBZ-hidroklorid pufferoldatot (pH 7,0) és 0,25 ml vizsgálandó anyagot tartalmazó oldatot 0,25 ml 0,002 mól töménységű arginin-0-naftílamidhoz adagolunk, majd a keveréket 37 °C-on 3 percig melegítjük. A meleg oldathoz 5 jul aminopeptizád B oldatot adunk, amelyet előzőleg a Hoppusu és mtsai. által leirt enzim-tisztitási módszer szerint DEAE-cellulózzal tisztítottunk. A keveréket 30 percen ót 37 °C-on hagyjuk állni, majd hozzáadunk 1 ml 1,0 mólos ecetsav-puffert (pH 4,2), amely még 1 mg/ml mennyiségben Fast Garnet GBC-t (o-amino-azotoluol diázoniumsó) és 10% mennyiségű Tween 20 felületaktív anyagot tartalmaz. Az így kapott keveréket 15 percen át szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd megmérjük az abszorpcióját 525 nm-en (a). Egyidejűleg a vakpróba - Arphamenine-t nem tartalmazó pufferoldat - abszorpcióját is meghatározzuk, (b). Az aminopeptidáz B százalékos inhibicióját a[(b-a)/b]xl00 egyenlet alapján határozzuk meg. Az előzőek szerint eljárva, 0,005 jug/ml Arphamenie A és 0,002 jug/ml Arphamenie B egyaránt az aminopeptidáz B hatásának 50%-os csökkenését okozza (ICso). Az Arphamenine a tenyésztés után egyaránt megtalálható a tápközegben és az Arphamenine-termelő mikroorganizmus sejtjeiben. Az Arphamenine kinyerését jó hozammal végezhetjük, ha a tenyészet szúrletét egy adszorbensen adszorbeáljuk, majd arról leválasztjuk. Ad szór bénaként alkalmazhatunk például aktív szenet, Amberlite XAD-4 és Diaion HP-20 ioncserélő gyantákat, aluminium-oxidot vagy szilikagélt. Például Amberlite XAD-4 alkalmazásánál a következőképpen járunk el: egy megfelelő oszlopot megtöltünk Amberlite XAD-4 gyantával (mennyisége 1/10 a tenyészetszűrlet mennyiségére számítva), majd a tenyészet szűrletét átengedjük az oszlopon. Az adszorbeálódott anyag eltávolítására az oszlopot először vízzel mossuk, majd az eluálást 50%-os vizes acetonnal végezzük, amelynek mennyisége 2-4-szerese a gyanta menynyiségének. Az igy nyert eluátum a tenyészet szűrletében lévő Arphamenine mennyiségnek több mint 70%-át tartalmazza. Az eluátumot végül csökkentett nyomáson beszáritjuk, igy a nyers Arphamenine-t por formájában kapjuk. Az ioncserélő gyantákkal végzett kromatografálást tisztítás céljára is felhasználhatjuk. Különösen a CM-Sephadex-en végzett kromatografálás hatásos, mivel ez lehetővé teszi az Arphamenine A és Arphamenine B elválasztását vizes nátrium-kloriddal végzett eluálással. Ha például az Amberlite XAD-4 gyantával adszorbeált és vizes acetonnal eluált anyagot CM-Sephadexen kromatografáljuk, majd az oszlopról az eluálást vizes sóoldattal, mint például nátrium-klorid-oldattal végezzük, külön Ö8szegyűjthetők az Arphamenine A és Arphamenine B frakciók. A találmány szerinti eljárással előállított anyag végső tisztítását Sephadex LH-20-szal történő sótalanitással végezzük. A találmány szerinti eljárással előállított Arphamenine-nek megvizsgáltuk a gyógyászati hatását, és azt találtuk, hogy erősiti a sejtközvetitett immunitást és rákellenes hatása van. A találmány szerint eljárással előállított Arphamenine A és B anyagokon végzett bio5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
