191803. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán inzulint kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó plazmid és E. coli baktérium előállítására
1 2 A 2. táblázatban a kétszálú DNS molekulákat kihúzott párhuzamos vonalakkal jelöljük, 5’- és 3 - végcsoportjaikat hidroxil- vagy foszfátcsoporttal (OH vagy 0P03H2) jelöljük. Az I esetben mindkét reagáló vegyület végén van 5’-foszfát-csoport, így mindkét szál kovalensen lesz kötve a reakció után. A II. esetben az összekötendő szálak közül csak az egyik rendelkezik 5 -foszfát-csoporttal, aminek következményeképpen reakció után egy kovalens kötés marad fenn (egyetlen egyszálú kötés), ugyanakkor a másik szálban egy törés marad. A kovalensen nem kötött szál kapcsolatban marad az összekapcsolódott szállal, mint ahogy ez az irodalomban jól ismert, a két szálat alkotó komplementer bázispárok között kialakuló hidrogén-hidak révén. A III esetben a reagáló DNS molekulák végei nem tartalmaznak 5 - foszfát-csoportot, így a kötődési reakció nem jön létre. A nem kívánatos kötődési reakciókat oly módon akadályozhatjuk meg, hogy a megfelelő reagáló molekulák végeit, ahol a kötődést nem kívánjuk akadályozni, az 5 -foszfát-csoportok eltávolítására kezeljük. Az 5 -foszfát-csoportok hasítására bármely olyan módszert használhatunk, amely más helyeken nem sérti a DNS molekula szerkezetét. Előnyösen az alkálikus foszfatáz enzim által katalizált hidrolízises reakciót választjuk. Az előzőekben ismertetett eljárás szemléltetésére a patkány inzulin szintézisét meghatározó cDNS-t izoláljuk és egy plazmiddal rekombináljuk. Az így nyert DNS molekulákat E. coli X-1776 törzs transzformálására használjuk. A transzformánsokat tetraciklont tartalmazó táptalajon növesztve szelektáljuk. A transzformált sejtekből kapott egyik rekombináns plazmid DNS olyan beépült DNS szakaszt tartalmazott, amely 410 nukleotidból állt. Hasonló eljárással izolált más rekombinánsokat is kaptunk és vizsgáltunk. A plazmidból a beépült DNS szakaszokat a Hind III vagy a Hsu I endonukleázzal kivitelezett emésztéssel szabadítottuk fel, majd Maxam és Gilbert módszerével (Proc. Natl. Acad. Sei., USA 74, 560, 1977) szekvencia-analízist végeztünk. A beépült DNS szakaszok nukleotid-sorrendje átfedő volt, és tartalmazta a patkány proinzulin 1 teljes kódját, továbbá a prepeptid 23 aminosava közül 13- ét. Az ismertetett szakasz nukleotid-sorrendjét az alábbiakban ismertetettek szerint készítettük el. Hasonló módon izoláltuk a patkány növekedési hormonját kódoló cDNS-t, majd plazmiddal rekombináltuk és E. coliba juttattuk. Az E. coli sejtek intenzív replikációja után olyan DNS molekulákat izoláltunk, amelyek körülbelül 800 nukleotidból áll lak, és tartalmazták a patkány növekedési hormon teljes kódját, továbbá a prekurzor fehérje kódjának egy részét és az 5 -nem transzformált szakasz egy részét is. A találmány szerinti eljárás általánosan alkalmazható magasabbrendű szervezetek, köztük az ember inzulin-génjeinek elkülönítésére és tisztítására, a gének mikroorganizmusokba való átvitelére és ugyanott bekövetkező replikációjukra. Olyan új rekombináns plazmidokat ismertetünk, amelyek a fenti izolált gént teljesen vagy részben tartalmazzák. A természetben eddig ismeretlen új mikroorganizmusokat írunk le, amelyek génjeikben egy magasabbrendű szervezetből származó inzulin géneket tartalmaznak. A találmány szerinti eljárás részletes szemléltetésére részletes példákat ismertetünk a találmány minden lépésére, a patkány inzulin génjeinek izolálására, tisztítására és bevitelére E. coli sejtekbe. A példákban jellemezzük a patkány inzulin génjét és az ember inzulin génjét tartalmazó rekombináns plazmidokat és az ezeket a géneket tartalmazó új mikroorganizmusokat. 1. példa Ismertetjük a patkány inzulin mRNS extrakcióját és izolálását, az erre komplementer DNS szintézisét és a komplementer DNS jellemzését. A patkány Langerhans sejtjeinek elkülönítésére egy altatott patkány hasnyálmirigyét Hank-sóoldattal kezeljük a hasnyálmirigy retrográd infúziójával. A Hank-sóoldat összetétele ismeretes az irodalomban, és több forrásból beszerezhető, például: Grand Island Biological Supply Company, Grand Island, New York, Egyesült Államok. Ezután eltávolítjuk a hasnyálmirigyet, a Hank-oldatban 0°C hőmérsékleten felvagdaljuk, majd kollagenáz enzimmel és szójabab tripszin-inhibitorral emésztjük. Minden ezt követő lépést 0°C és 4°C közötti hőmérsékleten végzünk, kivéve ha másként nem adjuk meg. Az emésztés körülményei rendkívül fontosak. 8 ml (teljes térfogat) Hank-sóoldatban lévő két apróba vágott patkány hasnyálmirigyet 30 ml térfogatú kémcsőbe helyezünk. Az összes használt kémcsövet szilikonnal előkezeljük (a szilikon beszerzési helye a következő: márkanév: Siliclad, Clay-Adams Division, Becton-Dickinson Inc., Parsippany, New Jersey, Egyesült Államok). Az inkubációs elegy 12 mg kollagenázt tartalmaz, amelyet Clostridium histolyticum-ból állítottak elő lényegében Mandl, Mackennan és Howes módszerével (J. Clin. Invest, 32, 1323, 1943), az enzim jele CLS IV, és a beszerzői hely: Worthington Biochemical Corporation, Freehold, New Jersey: az inkubációs elegy ezenfelül 1 mg, a Sigma Chemical Company-tól (St. Louis, Missouri, Egyesült Államok) vásárolt tripszin-inhíbitort tartalmaz. 37°C hőmérsékleten 25 percen át inkubáíjuk az elegyet, miközben percenként 90-szer kitérő rázóasztalon rázzuk. A rázatás során folyamatosan vizsgáljuk azt, hogy a kollagenáz emésztés elérte-e az optimális mértéket. Ha az inkubációs idő túl rövid, a Langerhans sejtek felszabadulása nem teljes, ugyanakkor, ha az inkubációs idő túl hosszú, úgy a sejtek lizise következhet be. Az inkubáció után egy percen át 200 g nehézségi gyorsulással centrifugálunk. A felülúszót kiöntjük, az üledéket Hank-oldattal mossuk, majd ezt 5 alkalommal megismételjük. Az utolsó centrifugálás után 15 ml Ficoll-ban (Pharmacia Chemical Company, Uppsala, Svédország) szuszpendáljuk az üledéket (a használt Ficoll sűrűsége 1,085). Ezután 8 ml 1,080 sűrűségű Ficoll-t, majd 5 ml 1,060 sűrűségű Ficoll-t rétegezőnk a szuszpenzióra, majd 5 percen át 5000, majd 5 percen át 2000 g nehézségi gyorsulással centrifugáljuk szögrotorban. A centrifugálás eredményeképpen az egyéb sejtek a centrifugacsö alján maradnak, míg a Langerhans sejtek a gradiens mentén felemelkednek, és a két felső réteg között egy sávot alkotnak. A Langerhans sejteket tartalmazó rész ganglionsejtekkel, limfomasejtekkel és szövetsejtekkel van fertőzve. A nagyméretű fertőző fragmenseket magában a centrifugacsőben 191 803 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 10
