191803. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán inzulint kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó plazmid és E. coli baktérium előállítására
1 2 távolítjuk el. Az így kapott készítményt mikroszkóp alá helyezzük, és az ott látható fertőző anyagokat kézzel, mikropipettával távolítjuk el. Ezután Hankoldattal hígítjuk a sejtkészítményt és centrifugáljuk. A feltilűszót kiöntjük, a sejteket tartalmazó üledéket pedig folyékony nitrogénben fagyasztva tároljuk. 4 mólos guanidium-tiocianátban (Tridom: Fluka AG Chemische Fabrik, Buchs, Svájc), amely 1 mól ß-merkaptoetanolt tartalmaz, és amelynek pH-ját 5,0-re állítottuk be és 4°C hőmérsékletre hűtöttük, 200 patkányból származó Langerhans sejteket homogenizálunk. A homogenizátumot 1,2 ml, 100 mM EDTA-t tartalmazó 5,7 mólos céziumkloridra rétegezzük, majd 18 órán át 15°C hőmérsékleten 37 000 percenkénti fordulat mellett Beckman ultracentrifugában SV 50,1 rotorban centrifugáljuk. (Beckman Instrument Company, Fullerton, Kalifornia, Egyesült Államok) Az RNS a centrifugacső alsó részén gyűlik össze. A poliadenilezett RNS-t a teljes RNS frakcióból oligo-(dT)-cellulóz oszlopon végzett kromatográfiával különítjük el Aviv és Leder módszere (Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 69,1408,1972) szerint. A patkány Langerhans sejtjeiből izolált teljes poliadenilezett RNS átmásolására cDNS-é mieloblasztózis vírusból izolált reverz transzkriptáz enzimet használunk: az enzimet Beardtól kaptuk (Life Science Inc., ST. Petersburg, Florida, Egyesült Államok), a reakciót 50 mmól/1 pH 8,3 trisz-HCl-t, 9 mmól/1 magnéziumkloridot, 30 mmól/1 nátriumkloridot, 20 mmól/1 ß-merkaptoetanolt, egyenként 1-1 mmól/l-nyi három nem radioaktív dezoxi-ribonukleozid-trifoszfátot, 250 juM negyedik, ad®32 jelzett (specifikus aktivitás 50-200 c/mól) dezoxi-nukleozidtrifoszfátot, 20 jug/ml oligo-dT - -t (Collaborative Research, Waltham, Masáaíti&setts, Egyesült Államok), 100 |b|g/ml poliadenilezett RNS-t és 200 E/ml reverz transzkriptáz enzimet tartalmazó reakcióelegyet 45°C hőmérsékleten 15 percen át inku’báljuk. Ezután 25 mmól/I EDTA-Na2-t adunk hozzá, majd azonos térfogatú vízzel telített fenollal extraháljuk. Elkülönítjük a vizes fázist, majd 0,3 cm átmérőjű és 10 cm magas Sephadex G-100 gyantából készült kromatografáló oszlopon kromatografáljuk. Az oszlopot 10 mmól/1 trisz-HCl-ot, pH 9,0, 100 mmól/1 nátriumkloridot és 2 mmól/1 EDTA-t tartalmazó eleggyel egyensúlyozzuk ki. A nukleinsavat etanollal csapjuk ki az eluátumból, miután 0,25 mmól/1 pH 6,0 ammóniumacetátot adunk hozzá. A csapadékot centrifugálással összegyűjtük, a centrifugálás után kapott üledéket 50 júl frissen készített 0,1 mól/1 nátriumhidroxid oldatban oldjuk, majd az RNS hidrolízisére 20 percen át 70°C hőmérsékleten inkubáljuk. Ezután 1 mólos pH 4,5 nátriumacetátot adunk az oldathoz annak semlegesítésére, majd a cDNS-P32-t etanollal kicsapjuk, és vízben újra oldjuk. Az egyszálú cDNS alikvot mintáit poliakril-amid gélen analizáljuk Dingman és Peacock módszerével (Biochemistry, 7, 659, 1968). A gélt megszárítjuk, majd a DNS-P32-t Kodak No-Screen NS-2T fűmmel (Eastman Kodak Corporation, Rochester, New York, Egyesült Államok) kivitelezett autoradiográfiával határozzuk meg. A cDNS heterodiszperz, ahogy azt az elektroforézises vizsgálat jelzi. A tennék túlsúlyban körülbelül 450 nukleotidból álló cDNS molekulákat tartalmaz, amint azt ismert anyaggal való összehasonlítás alapján kimutattuk. 2. példa Ismertetjük a patkány inzulin genetikai kódját tartalmazó kettős szálú cDNS szintézisét és jellemzését. Az 1. példa szerinti módon előállított egyszálú cDNS terméket a komplementer szál szintézise céljából reverz transzkriptáz enzimmel kezeljük. A reakciót a következő vegyületeket tartalmazó reakcióelegyben végezzük: 50 mmól/1 trisz-HCl, pH 8,3, 9 mmól/1 magnéziumklorid, 10 mmól/1 ditio-treitol, egyenként 50-50 mmól/1 három nem jelzett dezoxiribonukleozid-trifoszfátból, 1 mmól/1 a-P3 2-jelzett nukleotid-trifoszfát (specifikus aktivitás 1-10 c/ mmól/1, 50 pg/ml cDNS és 220 E/ml reverz transzkriptáz. 120 percen át 45°C hőmérsékleten inkubáljuk a reakcióelegyet. A reakciót 25 mmól/1 EDTA•Na2 adagolásával állítjuk le, majd fenollal extraháljuk, és az extraktumot Sephadex G-100 oszlopon kromatografáljuk. Az eluátumból a terméket etanollal kicsapjuk. A reakciótermék egy alikvot mintáját, amelynek aktivitása 500 cpm 1000 cpm közé esik, az 1. példában megadottak szerint gél-elektroforézissel vizsgáljuk. 450 nuklcotidnak megfelelő helyen egy heterodiszperz sáv látható (standard mintákkal való összehasonlítás alapján). Az 1. és 2. példákban megadottak szerint előállított DNS alikvot mintáit fölös mennyiségű restrikciós endonukleázzal (Hae III) kezeljük, és a fentiek szerint eljárva gélelektroforézisse! vizsgáljuk. Mindkét terméket hasítja az endonukleáz, így a radioaktivitás alapján meghatározott gélelektroforézises képen két sáv látható. A sávok a kettős szálú cDNS hasadásából származó termékekből adódnak, amik lényegében hasonló hosszúságot hasított termék jelenlétére utalnak, mint amit az egyszálú cDNS hasítása után kapunk. 3. példa Ismertetjük a Hind III érzékeny bázissorrendet tartalmazó kétszálú dekanukleotid (a továbbiakban Hind III dekanukleotid) hozzákapcsolását a 2. példa szerinti eljárással előállított és patkány Langerhans sejtekből izolált kétszálú cDNS egyszálú szakaszt nem tartalmazó végeihez. A 2. példa szerinti módon előállított kettős szálú reakcióterméket 2 pg/ml és 5 pg/ml koncentrációhatárok között 30 E, 1200 E/ml aktivitású, a Miles Laboratoriestől (Elkhart, Indiana, Egyesült Államok) vásárolt SÍ nukleázzal kezeljük. A reakciót 0,03 mól pH 4,6 nátriumacetátot, 0,3 mól nátriumkloridot és 4,5 mmól/1 cinkkloridot tartalmazó reakcióelegyben végezzük. 30 percen át 22°C hőmérsékleten inkubáljuk a reakcióelegyet, majd 15 percen át 10°C hőmérsékleten folytatjuk az inkubációt. Az emésztés leállítására 0,1 mól (végkoncentráció) trisz-bázist, 25 mmól/1 EDTA-t és Ehrenstein módszere szerint (Metho's in Enzymology, Colowick és Kaplan, 12A kötet, 588. oldal, 1967) előállított 40 júg/ml E. coli tRNS-t adunk a reakcióelegyhez. Fenollal extraháljuk az elegyet, majd Sephadex G-100 gyantából készült oszlopon kromatografáljuk, az eluált cDNS-P32-t etanollal kicsapjuk az ol191 803 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 11
