191803. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán inzulint kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó plazmid és E. coli baktérium előállítására
1 2 191 803 laszthatjuk a plazmiddal fertőzött sejteket, mivel az ilyen sejtekből kialakult telepek a gyógyszer jelenlétében nőnek, míg a plazmidot nem kapott sejtek nem nőnek, illetve nem fejlesztenek telepeket. A találmány szerinti eljárást szemléltető példákban olyan plazmidot használunk, amely a col El-bői származik, és amely a fentiekben ismertetett rezisztens markereken kívül egy, a Hind III enzimre érzékeny bázissorrendet is tartalmaz. A plazmid kiválasztásához hasonlóan a megfelelő gazdabaktérium kiválasztásakor is sok mikroorganizmus között választhatunk, azonban közbiztonsági okokból a felhasználható mikroorganizmusok száma igen kevés. A National Institute of Health engedélyét megkapta egy kitenyésztett E. coli törzs, ami az X-1776 sorszámot kapta, és aminek a jelen találmányban megadott eljáráshoz hasonló körülmények közötti használatakor a P2 rendelkezéseket kell figyelembe venni (Curtiss, Ann. Rev. Microbiol., 30, 507,1976). Azokon a helyeken, ahol a P3 lehetőségek állnak fenn, az E. coli RR-1 törzset lehet használni. Ahogy azt a plazmidok tárgyalásánál már megadtuk, a találmány szerinti eljárás vonatkozik bármely olyan gazdasejtre, amely képes felvenni a kiválasztott DNS molekulát, ilyen gazdasejt lehet a baktériumokon kívül például élesztő, abban az esetben, ha a törzsek kielégítik a National Institute of Health előírásait. A rekonbináns plazmidok előállítására a restrikciós endonukleáz enzimmel kezelt plazmid DNS-t olyan cDNS molekulákkal keverjük, amelyet hasonlóan kezelt végcsoportokat tartalmaznak. Annak a lehetőségnek a csökkentésére, hogy a cDNS darabok egymással kombinálódjanak, a plazmid DNS-t a cDNS-hez képest moláris feleslegben adjuk. Az eddig ismert módszerek szerint eljárva a feleslegben adott plazmid molekulák anélkül záródtak köralakúvá, hogy beépültek volna a cDNS molekulákba. A gazdasejtbe való bejuttatás során a sejtek elsősorban plazmidot és nem cDNS rekombináns plazmidokat tartalmaztak. Ennek az eredménye az volt, hogy 5 a szelekciós eljárás igen fárasztóvá és időrablóvá vált. Napjainkig ezt a nehézséget úgy kísérelték megoldani, hogy olyan DNS vektort terveztek, amely egy megfelelő marker gén közepén restrikciós endonukleázra érzékeny szakaszt tartalmaz, ily módon az adott rekombinánsnak a gazdasejt DNS molekukába ■0 való beépülésekor a gén ketté vált, aminek következményeként a gén által kódolt funkció elveszett. Előnyösen úgy járunk el, hogy a rekombináns plazmidok kiválasztására átvizsgálandó telepek számát kíséreljük meg csökkenteni. A módszer többek ..g között abban áll, hogy a restrikciós endonukleáz enzimmel hasított plazmid DNS-t alkálikus foszfatázzal kezeljük, amely enzim több forrásból, például a Worthington Biochemical Corporation, Freehold, New Jersey, Egyesült Államok, beszerezhető. Az alkálikus foszfatázzal való kezelés során a plaz- 20 mid endonukieázzal kialakított végeiről lehasadnak az 5’-terminális foszfátcsoportok, így megszűnik a lehetőség a plazmid DNS molekulák egymáshoz való kapcsolódására. Ennek az a következménye, hogy a molekula köralakúvá való alakulása, így a transzformáció is az 5’-terminális foszfátcsoportokat 25 tartalmazó DNS szakaszba való beépüléstől függ. Az így végzett kísérlet során a rekombináció nélkül bekövetkező transzformáció (a gazdasejtbe való behatolás) relatív gyakorisága 1—1 CT4 -nél kisebb lesz. A találmány szerinti eljárás azon a tényen alapszik, hogy a DNS-ligáz enzim által katalizált jeak^ ció a DNS 5 ’-foszfát-végcsoportja és a NDS 3 -hidroxil-végcsoportjai között következik be. Ha a terminális 5 -foszfát-csoportot eltávolítjuk, a kapcsolódási reakció nem következik be. Abban az esetben, ha kétszálú DNS molekulákat kapcsolunk össze, úgy 0Q 3 lehetőség áll fenn, a lehetőségeket a 2. táblázatban mutatjuk be. 2.táblázat Eset II 111 Reagáló vegyületek---------------OH---------------0P03H2 5’ 3’--------OH--------OH 5’ 3’--------OH--------OH 5’ A Iigáz hatására kialakuló termék .5» ~ " '3’ ' 5» H203P0------------------- ------------O-P-O---------------------------HO------------------- ------------O-P-O-------------------+2H20 3’ 5’ 3’ 5> 3’ 5’ H203P-0------------------- ------------O-P-O---------------------------OH—--------------------- ----------OH HO---------------------+H20 3’ 5’ 3’ 5’ HO------------------------------ nincs reakció ,HO------------------------------3’ 9
